蔡梅峰， 崔永生， 何文凱， 李明琰， 應(yīng)虹柳， 曾國鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科, 廣東 廣州 511400)

2型糖尿病患者微血管病變發(fā)生較早，當發(fā)生缺血性損傷時，組織恢復(fù)灌注的能力明顯受損，這導(dǎo)致冠心病的發(fā)病率和死亡率迅速上升[1-2].2型糖尿病患者微血管病變的發(fā)生可能與心臟微血管的新生功能障礙有關(guān).大量研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是細胞在低氧條件下調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵因子[3-4]，對下游眾多促進血管新生的基因，尤其是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有重要的調(diào)控作用[5].Dengler等[6]的研究表明，低氧可上調(diào)HIF-1α表達，進一步上調(diào)VEGF的表達，但高糖(葡萄糖)條件下、低氧合并高糖條件下HIF-1α和VEGF的表達情況及對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)新生功能的影響報道尚少.本研究應(yīng)用高糖及低氧條件下培養(yǎng)大鼠CMEC模擬2型糖尿病缺血心肌微血管的病理狀態(tài)，旨在探究高糖、低氧、高糖合并低氧時CMEC的HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平及其增殖、遷移、成管能力的變化.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與耗材

內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(貨號1001)購自美國Sciencell公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(貨號16000-044)、青鏈霉素混合液(貨號15140-122)、胰蛋白酶(貨號25200056)、無糖DMEM培養(yǎng)基(貨號11966)購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶(貨號C6885)、葡萄糖(glucose,Glu)(貨號G7528)、DAPI染色液(貨號S0091)購自美國Sigma公司；兔抗大鼠CD31多克隆抗體(貨號77699)、FITC標記的羊抗兔IgG(貨號4412)購自美國CST公司；CCK8試劑盒(貨號CK04)購自日本同仁研究所；5×PrimeScript RT Master Mix(貨號RR036A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(貨號RR820)購自日本TaKaRa公司；transwell小室(貨號3421)、Matrigel 基質(zhì)膠(貨號356234)、離心管(貨號430791)、細胞培養(yǎng)板(貨號3599/3524/3516)、培養(yǎng)皿(貨號430166/430167)、200目網(wǎng)狀過濾器(貨號352340)購自美國Corning公司；水合氯醛(貨號S24149)購自北京鼎國生物有限公司；質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛(貨號P0099)、體積分數(shù)為1%的Triton X-100(貨號ST795)購自中國碧云天公司.

1.1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠10只，12周齡，體質(zhì)量為250～300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)20130034.

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠心臟CMEC的分離培養(yǎng)

參考Nishida等[7]消化分離大鼠CMEC的方法.用質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉處死SD大鼠后取其左心室，在體積分數(shù)為70%的乙醇中浸泡30 s，HBSS緩沖液清洗3遍，將心肌組織在質(zhì)量分數(shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶中剪碎，在37 ℃振蕩水浴中溫育30 min，加入質(zhì)量分數(shù)為0.02%的胰蛋白酶后繼續(xù)水浴震蕩30 min，然后終止消化，200目網(wǎng)狀過濾器過濾消化后的液體，在25 ℃下，100 g/min離心5 min，將細胞懸浮于ECM完全培養(yǎng)基(ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分數(shù)為5%的胎牛血清+體積分數(shù)為1%的內(nèi)皮細胞生長添加物+體積分數(shù)為1%的青鏈霉素混合液)中，接種于用層粘連蛋白預(yù)處理45 min的培養(yǎng)皿中，37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，之后每3 d換液，待細胞生長融合至80%后，用體積分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代.取第3代細胞用于實驗.

1.2.2 CMEC的鑒定

細胞消化傳代接種于放有細胞爬片的培養(yǎng)皿中，待細胞生長融合至80%，棄去培養(yǎng)基，質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，體積分數(shù)為1%的Triton X-100破膜10 min，PBS洗3次后加入正常羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠CD31抗體于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入羊抗兔二抗后避光室溫孵育50 min，用PBS洗3次，加入DAPI染色液，避光室溫孵育10 min，PBS洗3次，晾干后滴上適量的抗猝滅封片劑，蓋上載玻片，避免氣泡，熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照.

1.2.3 CMEC的分組處理

將培養(yǎng)的CMEC分為4組，每組培養(yǎng)時均用ECM完全培養(yǎng)基，在加處理因素前12 h換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基，具體分組見表1：

表1 分組處理情況Table 1 The process of the groups

1.2.4 Real-time PCR法檢測CMEC的HIF-1α、VEGF的mRNA表達水平

每組再培養(yǎng)48 h后，采用Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度及濃度，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后使用TaKaRa擴增試劑盒進行PCR擴增.HIF-1α的上游引物為5′-ACAGCACATTCA-CAGCTCCCCA-3′，下游引物為5′-TGTGGCTACC-ATGTACTGCTGGC-3′；VEGF的上游引物為5′-GGAGTACCCCGATGAGATAGAGT-3′，下游引物為5′-CTATGTGCTGGCTTTGGTGAG-3′；內(nèi)參β-actin的上游引物為5′-TCAGGTCATCACTATC-GGCAAT-3′，下游引物為5′-AAAGAAAGGGTG-TAAAACGCA-3′，在熒光定量PCR儀上的擴增條件是：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次.用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量.

1.2.5 CCK-8法檢測CMEC的增殖能力

每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞制成單細胞懸液，把細胞濃度調(diào)整為 2×104個/mL.在96孔板每孔中接種100 μL的細胞懸液，37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后向每孔中加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定450 nm處的OD值.

1.2.6 transwell小室實驗檢測CMEC的遷移能力

每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞制成單細胞懸液，把細胞濃度調(diào)整為 5×105個/mL.按每孔5×104個細胞接種于transwell侵襲小室的上室，而在下室內(nèi)加入500 μL ECM完全培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后取出小室，用棉簽將上室內(nèi)細胞輕輕擦拭干凈，用甲醇室溫固定20 min，再用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色3 min，用PBS沖洗干凈后晾干，在×100顯微鏡下觀察拍照.

1.2.7 體外小管形成實驗檢測CMEC的成管能力

48孔培養(yǎng)板、200 μL槍頭、基質(zhì)膠4 ℃過夜預(yù)冷，用預(yù)冷的槍頭加100 μL基質(zhì)膠于預(yù)冷48孔培養(yǎng)板中，37 ℃包被30 min.每組加處理因素再培養(yǎng)48 h后，使用體積分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞制成單細胞懸液，把細胞濃度調(diào)整為 2×105個/mL，每孔接種200 μL單細胞溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h.在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，使用Image-Pro計數(shù)由內(nèi)皮細胞圍成完整的毛細血管管腔的數(shù)量.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CMEC的鑒定

DAPI(藍色熒光)和CD31(綠色熒光)雙染色后，CMEC會雙陽性表達.熒光染色結(jié)果顯示，所分離細胞中雙陽性表達的細胞數(shù)目占總細胞數(shù)目的95%以上，可進行下一步實驗(圖1).

A：DAPI染色后細胞核可見藍色熒光；B：CD31染色后細胞漿可見綠色熒光；C：A、B合成圖

A：Blue fluorescence can be seen in the nucleus after DAPI staining；B：Green fluorescence can be seen in cytoplasm after CD31 staining；C：A, B Composite picture

圖1 熒光染色鑒定心臟微血管內(nèi)皮細胞(×100)

Fig.1 Assessment of cardiac microvascular endothelial cells with fluorescent staining (×100)

2.2 各組細胞HIF-1α和VEGF的mRNA表達

HIF-1α的mRNA表達水平在NG組與HG組之間、HNG組與HHG組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明氧氣的體積分數(shù)相同時，高糖對CMEC的HIF-1αmRNA表達影響不明顯； HNG組HIF-1α的mRNA表達水平明顯高于NG組(P<0.05)，HHG組HIF-1α的mRNA表達水平明顯高于HG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時，低氧可促進CMEC的HIF-1αmRNA表達(圖2).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05

NG組VEGF的mRNA表達水平高于HG組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，HNG組VEGF的mRNA表達水平明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分數(shù)相同時，高糖可抑制CMEC的VEGFmRNA表達；HNG組VEGF的mRNA表達水平明顯高于NG組(P<0.05)，HHG組VEGF的mRNA表達水平明顯高于HG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時，低氧可促進CMEC的VEGFmRNA表達(圖3).

2.3 各組細胞的增殖能力

NG組細胞的增殖能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細胞的增殖能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分數(shù)相同時，高糖可抑制CMEC增殖；NG組細胞的增殖能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細胞的增殖能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時，低氧可抑制CMEC增殖(圖4).

2.4 各組細胞的遷移能力

NG組細胞的遷移能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細胞的遷移能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明氧氣的體積分數(shù)相同時，高糖可抑制CMEC遷移；NG組細胞的遷移能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細胞的遷移能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時，低氧可抑制CMEC遷移(圖5).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

圖3VEGF的mRNA表達水平

Fig.3 The expression level ofVEGFmRNA

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

圖4 細胞的增殖能力

Fig.4 The proliferation of the cells

2.5 各組細胞的成管能力

NG組細胞的成管能力明顯高于HG組(P<0.05)，HNG組細胞的成管能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明體積分數(shù)相同時，高糖可抑制CMEC小管形成能力；NG組細胞的成管能力明顯高于HNG組(P<0.05)，HG組細胞的成管能力明顯高于HHG組(P<0.05)，表明糖的濃度相同時，低氧可抑制CMEC小管形成能力(圖6).

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

1)與NG組比較，P<0.05；2)與HG組比較，P<0.05；3)與HNG組比較，P<0.05

3 討論

CMEC對調(diào)節(jié)血管內(nèi)平衡有至關(guān)重要的作用，不但可以為血管提供一個功能性屏障，還可參與血管舒縮功能的調(diào)節(jié)，對血管壁抗血小板、抗炎、抗增殖和抗氧化信號的調(diào)控也有重要作用[8].2型糖尿病會損害心肌微血管血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致血管新生障礙，心肌微血管生成不足，心臟毛細血管密度降低，側(cè)支循環(huán)減少，心肌處于缺血缺氧狀況，從而增加了心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險.Marfella等[9]研究表明，鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支復(fù)制心肌梗死模型后，其心肌梗死面積大于非糖尿病大鼠和血糖控制良好的糖尿病大鼠，進一步研究發(fā)現(xiàn)，這與HIF-1α的基因表達減少有關(guān).Catrina等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動物模型的傷口中HIF-1α和HIF-1靶基因的水平降低，導(dǎo)致細胞缺氧、傷口愈合時間延長.HIF-1α廣泛參與多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，在低氧環(huán)境下，HIF-1α與靶基因低氧反應(yīng)元件結(jié)合,促進包括VEGF在內(nèi)的眾多血管生成因子基因的轉(zhuǎn)錄翻譯及心肌的能量代謝[11].因此推測高糖通過影響HIF-1α的表達而引起VEGF的表達減少，可能是糖尿病患者心肌微血管新生障礙的發(fā)生機制.

本研究在不同濃度的葡萄糖和不同體積分數(shù)的氧氣的條件下培養(yǎng)大鼠CMEC，檢測促血管生成因子HIF-1α和VEGF的mRNA表達和CMEC增殖、遷移、成管能力的變化.Real-time PCR結(jié)果表明，葡萄糖的濃度相同時，低氧環(huán)境中HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平均明顯高于常氧，提示低氧是促進HIF-1αmRNA表達的重要因素，HIF-1αmRNA表達增強，促進了下游VEGF的表達.氧氣的體積分數(shù)相同時，葡萄糖濃度的高低對HIF-1α的mRNA表達沒有顯著影響，而高糖則會降低VEGF的mRNA表達，可能的機制是，高糖不會影響HIF-1α的基因表達，但是可能會降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性.那么，高糖是通過什么機制降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性的？有研究表明，高糖的作用可以被甘露醇模擬代替[12]，提示可能與滲透壓升高有關(guān)；Botusan等[13]的研究認為糖尿病大鼠心肌HIF-1α與下游基因結(jié)合的活性降低，會使其目的基因如VEGF表達下降；也有研究顯示，高糖條件下糖代謝異常導(dǎo)致細胞和血漿中甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)水平升高，影響了HIF-1α蛋白與P300/CBP蛋白的聚合，使得VEGF的上調(diào)受到抑制[14].

缺氧是對機體的一種損傷，組織發(fā)生缺血缺氧時能量利用會發(fā)生障礙，無氧代謝產(chǎn)物蓄積，細胞功能紊亂甚至導(dǎo)致組織壞死.但是正常機體對缺氧是有代償作用的，比如，在發(fā)生心肌梗死時，心臟血管新生正向調(diào)節(jié)因子表達會增強，啟動血管新生過程，建立側(cè)支循環(huán)[15].然而糖尿病患者對缺氧的反應(yīng)會減弱，已有臨床研究和實驗結(jié)果表明，伴有2型糖尿病的心肌梗死患者，心肌組織的毛細血管密度明顯降低，梗死面積增加，并且更容易發(fā)生心梗后心絞痛以及充血性心力衰竭[9].高糖會促進血管內(nèi)皮細胞活性氧家族(reactive oxygen species，ROS)的生成，激活蛋白激酶C通路或晚期糖基化終產(chǎn)物形成通路等，從而誘導(dǎo)CMEC損傷[16-17].這些與本實驗中發(fā)現(xiàn)高糖和低氧環(huán)境損傷CMEC的增殖能力、遷移能力和小管形成能力是一致的.

綜上所述，高糖不但降低了缺氧環(huán)境下大鼠CMEC促血管生成因子的基因表達，而且損傷了細胞的增殖、遷移和小管形成能力，提示我們，對于2型糖尿病合并心肌缺血患者，可以通過強化控制血糖及外源補充促血管生成相關(guān)因子來減輕高糖低氧對CMEC新生能力的影響，減輕臨床癥狀、改善預(yù)后，為2型糖尿病合并缺血性心臟病的研究提供新的思路.但是，HIF-1α下游信號分子錯綜復(fù)雜，許多通路尚不能完全闡明，故仍有許多問題等待解決.