聶玲輝， 黃杰聰， 謝煒， 伍志勇

(1.廣東省第二人民醫(yī)院 傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動(dòng)傷害康復(fù)研究所， 廣東 廣州 510317；2.廣州市從化區(qū)中醫(yī)院， 廣東 廣州 510990； 3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515)

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，發(fā)作時(shí)常伴思維遲緩、意志活動(dòng)減退等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)食欲減退、體質(zhì)量減輕等軀體化癥狀.WHO在2017年最新發(fā)布的報(bào)告中指出，全球抑郁癥患者約有3.22億，患病率為4.4%，我國抑郁癥患病率約為4.2%[1-2]，且到2020年抑郁癥將成為第2大致殘疾病[3].抑郁癥病因復(fù)雜,涉及多種發(fā)病機(jī)制，主要包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸亢進(jìn)假說、腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、氧化應(yīng)激假說等.近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)可破壞機(jī)體的機(jī)能，并參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[4].抑郁癥屬于中醫(yī)“郁病”范疇，其病因病機(jī)主要與肝氣郁結(jié)有關(guān).陳寶田教授[5]根據(jù)其50年的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為情志相關(guān)疾病應(yīng)從心肝論治，從心肝論治治療抑郁癥以通過調(diào)五臟以調(diào)情志，情志調(diào)和則肝得以正常疏泄，情志亦可舒暢，并提出安神法應(yīng)作為其治療大法.安神方顆粒(anshenfangkeli，ASF)在該理論基礎(chǔ)的指導(dǎo)下應(yīng)用于臨床并達(dá)到顯著的抗抑郁效果.然而，ASF的抗抑郁作用機(jī)理尚不清楚.本研究通過建立慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)誘導(dǎo)的大鼠抑郁癥模型，選取細(xì)胞因子、激素及神經(jīng)遞質(zhì)等西醫(yī)的微觀指標(biāo)，從多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、多層面來闡明中藥作用于人體的整體作用，以明確ASF的抗抑郁樣作用及其機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(160～200)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK粵2006-0015).飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23 ℃～25 ℃，濕度為50%～60%，自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn).

1.2 試劑及儀器

ASF顆粒組成：柴胡、黃芩、黨參、半夏、生姜、大棗、甘草、桂枝、白芍、龍骨、牡蠣、棗仁、遠(yuǎn)志、合歡皮、夜交藤(由南方醫(yī)院提供).大鼠GAPDH抗體(SMOBIO公司)；BDNF抗體(Proteintech公司)；GABAA受體α2亞基抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(杰貝斯生物有限公司)；大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor ncrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特)；BCA蛋白定量試劑盒(上海貝博生物有限公司)；BIO-R 40型電泳儀(美國伯樂公司)；Kodak2000MM型凝膠成像系統(tǒng)(美國柯達(dá)公司)；Eoipse Ti-s型倒置顯微鏡(日本尼康公司).

1.3 CUMS造模及分組

30只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及安神方顆粒組，每組10只.除空白組外，其余各組進(jìn)行慢性溫和不可預(yù)知刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)，刺激包括：禁食24 h，禁水24 h，光照24 h，4 ℃冷水游泳5 min，潮濕墊料(200 mL水/籠，24 h)，鼠籠45°傾斜(24 h)，夾尾(1 min).每天隨機(jī)安排1種刺激，連續(xù)2 周.后續(xù)3周進(jìn)行CUMS 1 h前，安神方顆粒組每天給予安神方顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 g/kg灌胃，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃.

1.4 抑郁行為學(xué)觀察

1.4.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)

分別于2、5周，將大鼠置于水深25 cm的游泳筒(高46 cm，直徑21 cm)，水溫為23 ℃～25 ℃，記錄大鼠在5 min內(nèi)的累積不動(dòng)時(shí)間.游泳完成后及時(shí)用毛巾擦干.

1.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)(SPT)

糖水偏好值=糖水?dāng)z入量/(糖水?dāng)z入量+蒸餾水?dāng)z入量).

1.5 標(biāo)本采集與儲存

各組大鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)后，用戊巴比妥鈉麻醉，立即取腦，冰袋上迅速分離海馬，一部分立即放入液氮凍存，再放入-80 ℃低溫冰箱保存，一部分放入帶RNA保護(hù)液的EP管中，放入-80 ℃低溫冰箱保存.每組取完整大腦半球放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定，制備厚度為4 μm的石蠟切片炎癥因子的測試.

1.6 海馬組織中炎癥因子的檢測

稱取各組大鼠海馬，加入適量預(yù)冷生理鹽水，在冰浴條件下超聲粉碎，于4 ℃ 5 000×g下離心10 min，取上清，嚴(yán)格按照IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書步驟檢測炎癥因子的含量.

1.7 免疫熒光

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)主動(dòng)脈灌注生理鹽水并剪開右心耳，至流出液體較清亮后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液灌注至大鼠尾巴變僵硬.斷頭取腦，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液固定24 h后，依次放置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%蔗糖脫水，組織沉底后OCT包埋.切片，厚度為40 μm，貼好的切片37℃烤1 h，PBS洗5 min×3次，PBS洗5 min×3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%牛血清蛋白(BSA)封閉1 h，加入一抗；空白組以PBS代替一抗.4 ℃冰箱孵育過夜，滴加免疫熒光二抗，避光孵育1 h.滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 5 min，PBS洗5 min×3次，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果.運(yùn)用Imagepro-plus圖像處理軟件系統(tǒng)分析.

1.8 Western Blotting

用RIPA裂解液和甲苯基酰氟(PMSF)提取海馬總蛋白；BCA法測定總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠，120 V電泳1.5 h，90 V轉(zhuǎn)膜90 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，洗膜緩沖液(TBST)洗滌3次后，加一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次后，加入二抗室溫孵育1 h，洗滌3次后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影，分別運(yùn)用成像系統(tǒng)和Imagepro-plus采集、分析圖像.以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算BDNF和GABAARα2蛋白的相對表達(dá)量.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 安神方顆粒對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠體質(zhì)量增加的影響

干預(yù)2周CUMS刺激后，模型組和安神組間大鼠體質(zhì)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，較空白組體質(zhì)量均增加緩慢(P<0.01).治療3周后，模型組大鼠體質(zhì)量增加較空白組緩慢(P<0.01)；安神方顆粒組大鼠體質(zhì)量增加較模型組快(P<0.01，表1).

表1 安神方顆粒對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠體質(zhì)量增加的影響

組別n2 周5周空白組1059.01±17.1473.12±20.51模型組1036.31±12.831)42.42±16.431)ASF組1033.62±14.911)59.81±18.452)

1)P<0.01 與空白組比較； 2)P<0.01與模型組比較.

2.2 安神方顆粒對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響

進(jìn)行2周CUMS刺激后，與空白組比較，模型組和安神方顆粒組大鼠強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間均延長(P<0.01)，糖水偏好值均減少(P<0.01)；模型組和安神方顆粒組大鼠強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間、糖水偏好值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).治療3周后，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較空白組延長(P<0.01)，糖水偏好值明顯減少(P<0.01)；安神方顆粒組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較模型組縮短(P<0.01)，糖水偏好值升高(P<0.01，表2).

組別nt強(qiáng)迫游泳/s糖水偏好值2周5周2周5周空白組1057.26±15.3566.12±17.560.71±0.090.79±0.1模型組1089.61±21.201)111.32±28.421)0.50±0.081)0.44±0.051)ASF組1091.37±19.611)79.35±21.822)0.49±0.081)0.69±0.072)

1)P<0.01與空白組比較； 2)P<0.01與模型組比較.

2.3 各組大鼠海馬炎癥因子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

給藥3周后，模型組大鼠的炎癥因子IL-1β 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組增高(P<0.01)，安神方顆粒組大鼠的炎癥因子IL-1β 較模型組降低(P<0.01)，而且經(jīng)檢測炎癥因子TNF-α 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的炎癥因子TNF-α 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組增高(P<0.01)，安神方顆粒組大鼠的炎癥因子TNF-α 較模型組降低(P<0.01，圖1).

1)P<0.01 vs model; 2)P<0.01 vs control.

2.4 安神方顆粒對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬BDNF和GABAARα2表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬BDNF和BGABAARα2表達(dá)水平降低(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，安神方顆粒組大鼠海馬BDNF和GABAARα2表達(dá)水平升高(P<0.01，P<0.01，圖2).

2.5 免疫熒光染色

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回均有不同程度BDNF、GABAARα2陽性表達(dá).與空白組比較，模型組大鼠馬CA1區(qū)和齒狀回BDNF、GABAARα2陽性細(xì)胞數(shù)較少；與模型組比較，安神方顆粒組大鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回BDNF和GABAARα2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖3、圖4).

1)P<0.01 vs control; 2)P<0.01 vs model.

圖3 各組大鼠海馬齒狀回BDNF和GABAARα2陽性表達(dá)

Fig.3 Expression of BDNF and GABAARα2 in the dentategyrus region of rats in different groups observed by immunofluorescence (×200).

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和GABAARα2陽性表達(dá)

3 討論

抑郁癥是一種患病率高、致殘性高、負(fù)擔(dān)性高的疾患，為困擾全球人類健康的嚴(yán)重問題[7-8].慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)抑郁模型能有效地模擬人們生活中遇到不可預(yù)知的刺激，是公認(rèn)的動(dòng)物抑郁模型，被廣泛地用于抗抑郁藥的篩選[9].本實(shí)驗(yàn)給予各組大鼠2周CUMS刺激后出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢，糖水消耗量減少，強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間延長，表現(xiàn)出興趣和快感下降等抑郁癥狀，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[10]，說明CUMS抑郁模型復(fù)制成功.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與相應(yīng)的GABA受體(GABAAR)結(jié)合而產(chǎn)生的遞質(zhì)代謝在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要調(diào)控作用.GABAAR作為腦內(nèi)最重要的抑制性受體，其α2亞基是GABAAR重要組成部分，通過激活GABAARα2可產(chǎn)生抗抑郁的作用[11].研究表明GABAARα2基因敲除小鼠在新奇事物攝食實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出焦慮、抑郁樣行為[12].同時(shí)GABAAR及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)表達(dá)的異常共同參與了抑郁癥的病理生理過程[13-14].而BDNF的釋放與GABAAR有關(guān).激活GABAAR可引起電壓門控鈣離子通道(voltage-gated Ca2+channels，VGCCs)開放，增加Ca2+內(nèi)流，使神經(jīng)元去極化，引起Ca2+依賴的BDNF釋放；而BDNF/rkb信號通路可以抑制GABAAR的內(nèi)吞和增加其在細(xì)胞表面的表達(dá)[15].因此與遞質(zhì)代謝有關(guān)的GABAAR與BDNF/Trkb信號通路可形成正反饋調(diào)控機(jī)制，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增值、遷移、分化及突觸的可塑性[16]，以參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展.

有研究表明神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂是由細(xì)胞因子水平紊亂引起，從而引發(fā)抑郁；反之，當(dāng)患上抑郁癥后神經(jīng)遞質(zhì)下降又可引起患者的免疫功能紊亂而導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌異常的表達(dá)[17].細(xì)胞因子是一類蛋白質(zhì)或小分子多肽，在人體中具有調(diào)控免疫應(yīng)答生物活性的能力，屬于調(diào)控人體神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的重要因子.臨床上抑郁癥患者血液檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β水平普遍升高[18].小鼠經(jīng)過慢性溫和應(yīng)激后，其IL-1β表達(dá)水平在外周及中樞海馬區(qū)明顯升高，而且出現(xiàn)行為學(xué)呈抑郁樣改變，但是如果對IL-1受體敲除小鼠應(yīng)用同樣的應(yīng)激方式，則不能引起其抑郁樣行為學(xué)改變[19]. 有研究提示TNF-α和IL-1β可以調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的攝取，通過激活絲裂原活化蛋白激酶，催化一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終使5-HT的再攝取增加，減少5-HT的濃度[20]，而5-HT的濃度降低，最終會誘發(fā)焦慮抑郁.既往研究證實(shí) GABA 可通過 GABABR 和 GABAAR 調(diào)節(jié)中縫背核5-HT水平[21]，由此可得出，炎癥因子IL-1β及TNF-α可誘發(fā)的抑郁癥可能與GABABR有關(guān).本研究通過CUMS構(gòu)建的抑郁癥動(dòng)物模型，其炎癥因子IL-1β及TNF-α 的水平較空白組增高.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光和Western blotting技術(shù)檢測各組大鼠海馬BDNF和GABAARα2的表達(dá)，結(jié)果顯示模型組大鼠海馬BDNF和GABAARα2表達(dá)較空白組明顯減少.以上研究表明，慢性應(yīng)激可以通過下調(diào)海馬BDNF和GABAARα2的表達(dá)從而介導(dǎo)抑郁的發(fā)生，而且其發(fā)生過程與炎癥反應(yīng)有關(guān).

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁病”范疇，其病因病機(jī)主要是肝氣郁結(jié).陳寶田教授(全國名老中醫(yī)，將軍教授)從醫(yī)50載，在臨床診治抑郁癥方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，陳老認(rèn)為情志相關(guān)疾病應(yīng)“從心肝論治”，并提出：除中醫(yī)八法之外，還應(yīng)當(dāng)將安神法作為中醫(yī)治法的另一治療大法.心為君主之官，主血脈和神志，司五臟六腑之主，心神明則臟腑安，心動(dòng)則五臟六腑皆搖；同時(shí)心亦主身之血脈，諸血皆歸入心，肝藏血，主疏泄，調(diào)節(jié)精神情志.安神法通過調(diào)五臟以調(diào)情志，情志調(diào)和則肝得以正常疏泄.安神方顆粒是根據(jù)此理論而創(chuàng)立的，方中小柴胡湯，疏肝解郁，調(diào)節(jié)情志；桂枝、芍藥調(diào)和陰陽；龍骨、牡蠣、酸棗仁、合歡皮、夜交藤寧心安神，全方共湊疏肝解郁、寧心安神之效，該方臨床上治療抑郁癥取得了良好的效果.本研究結(jié)果顯示，造模成功后予以安神方顆粒進(jìn)行治療，大鼠體質(zhì)量增長較快，糖水消耗量增加，強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間縮短，提示安神方顆粒具有良好的抗抑郁作用.與模型組比較，安神方顆粒組大鼠海馬炎癥因子IL-1β及TNF-α的水平均降低，而且BDNF和GABAARα2的表達(dá)明顯上升，推測安神方顆粒可通過上調(diào)BDNF和GABAARα2的表達(dá)從而發(fā)揮抗抑郁的作用，其發(fā)揮抑郁治療作用與炎癥反應(yīng)有關(guān).由此可見，安神方在疏肝解郁、寧心安神的治療方法指導(dǎo)下，通過多途徑、多靶點(diǎn)、多層面干預(yù)細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮抗抑郁的作用，這為臨床使用安神方顆粒治療抑郁癥提供了有力實(shí)驗(yàn)依據(jù).