邢麗 宋爾霖 賈西貝 馬靜 李冰 高旭

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1腎內(nèi)一科，2泌尿外科（哈爾濱150001）；3哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)二科（哈爾濱150086）；4哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子學(xué)科（哈爾濱150086）

急慢性腎損傷在臨床中具有很高的發(fā)病率，但是目前治療方法相對(duì)有限，如果可以促進(jìn)腎臟固有細(xì)胞的增生，可以明確地促進(jìn)腎臟的修復(fù)。近年來，關(guān)于干細(xì)胞治療各種疾病特別是血液疾病在臨床中取得了很好的療效。目前已有研究表明不論是混合的骨髓干細(xì)胞還是單純的骨髓造血干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)急性腎損傷的修復(fù)。腎損傷模型包括由雷帕霉素、甘油、葉酸、慶大霉素及缺血再灌注而導(dǎo)致腎損傷［1-2］，但具體的機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)即應(yīng)用尾靜脈注入的方法證實(shí)干細(xì)胞是否可以促進(jìn)急性缺血再灌注腎臟損傷的修復(fù)及相關(guān)的機(jī)制，為干細(xì)胞治療急性腎損傷提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性BALB/C小鼠，體質(zhì)量20～25 g，月齡6～8周，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器DMEM/HIGH GLUCOSE（1×）（HyClone賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司），胎牛血清（HyClone賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司），DMSO（AMRESCO，DMSO-Dime Thylsulfoxide，ultra pure grade），Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit（Invitrogen），rat-anti-mouse CD31 14-0311-82（eBioscience），rabbit anti-mouse ki67（SP6）RM-9106-S0（NeoMarkers），OCT Compound 冰凍切片包埋劑（中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 分組及準(zhǔn)備小鼠隨機(jī)分為2組，缺血再灌注模型組和干細(xì)胞治療組，每組15只，采用雙側(cè)腎動(dòng)靜脈夾閉28 min或單腎夾閉30 min的方法建立缺血再灌注腎損傷模型，并采取小鼠股骨骨髓提取并體外貼壁培養(yǎng)方法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并擴(kuò)增干細(xì)胞，為在體內(nèi)更好地追蹤干細(xì)胞將干細(xì)胞與CMFDA綠色染料孵育，為證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎臟的保護(hù)作用，制成單腎缺血再灌注模型后的一天后通過尾靜脈注入的方式將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（106/mL）500 μL注入到小鼠體內(nèi)，在術(shù)后3、5、7 d通過血、腎臟病理及相關(guān)免疫熒光檢測評(píng)價(jià)腎臟損傷。

1.2.2 干細(xì)胞用流式細(xì)胞儀鑒定分別用CD73、CD90、CD45標(biāo)記，取200 μL放入白色EP管中，保證細(xì)胞數(shù)為106個(gè)，按照不同的組別加入抗體，上機(jī)。

1.2.3 腎功的測定分別于不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血，5 000 r/min離心10 min，取上清液采用VP-Suppwr Sysuem自動(dòng)生化分析儀檢測腎功。

1.2.4 光鏡檢查腎組織行HE染色，光鏡下觀察腎臟病理變化，對(duì)腎小管間質(zhì)損傷進(jìn)行定量評(píng)估，方法如下：將每個(gè)視野分為256個(gè)小格，如果小格范圍內(nèi)存在腎小管損傷（腎小管變扁平、凋亡、壞死或出現(xiàn)管型）則為1分，每個(gè)腎臟取10個(gè)視野，取平均值。

1.2.5 免疫熒光冰凍切片厚度4 mm行免疫熒光染色，CD31用于標(biāo)記小鼠管周毛細(xì)血管密度（1∶100，eBioscience），KI 67用于標(biāo)記增生的細(xì)胞（1∶100，NeoMarker），DAPI用于染細(xì)胞核（1∶200，Invitrogen，SanDiego，CA，USA）。管周毛細(xì)血管的丟失計(jì)算方法同HE病理計(jì)數(shù)方法，使用OLYMPUS FLOUVIEW FV1000免疫熒光儀拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Kaplan-Meier方法計(jì)算生存率的差異，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定采用貼壁培養(yǎng)方法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在不斷換液的過程中骨髓造血干細(xì)胞被不斷地剔除，取第四代傳代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞鑒定。光鏡下可以觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有典型的梭形形態(tài)（圖1A），同時(shí)免疫熒光染色制作細(xì)胞爬片可以觀察到干細(xì)胞具有典型的紡錘形、梭形形態(tài)（圖1B），圖1C為流式細(xì)胞散點(diǎn)圖，圖1D分別細(xì)胞表面分子CD73、CD90及CD45單參數(shù)直方圖，結(jié)果顯示干細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90但不表達(dá)CD45（圖1C、D），證實(shí)培養(yǎng)的干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2 CMFDA染色的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以被特異招募到腎臟在單腎缺血再灌注模型中，在造模后的24 h后經(jīng)尾動(dòng)脈注入的方法將通過CMFDA染色的骨髓干細(xì)胞注入到模型鼠體內(nèi)。在造模后的3、5、7 d分別處死小鼠，分別第3、5、7天在左側(cè)腎臟隨著時(shí)間的延長招募的骨髓干細(xì)胞逐漸減少（圖2A-C），第3及5天較同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)腎臟干細(xì)胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05）。右側(cè)腎臟在術(shù)后3 d招募的干細(xì)胞數(shù)量很少（圖2D）；不同時(shí)間點(diǎn)左側(cè)及右側(cè)腎臟招募干細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化（圖2F）；在術(shù)后第3天招募到脾臟的干細(xì)胞（圖2E）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示招募到受損腎臟的數(shù)量明顯高于未受損傷的腎臟，表明干細(xì)胞的招募是特異性的，并隨時(shí)間的延長逐漸減少，干細(xì)胞首先招募到內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)，提高生存率并增加體質(zhì)量為了證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可以促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)，雙側(cè)腎臟動(dòng)靜脈夾閉28 min的小鼠模型在不同時(shí)間點(diǎn)檢測血肌酐及尿素氮來評(píng)價(jià)腎臟功能，術(shù)后24 h后肌酐及尿素氮較術(shù)前明顯增加，增加約5～6倍，并隨著時(shí)間的延長肌酐及尿素氮水平逐漸下降，但至術(shù)后第7天仍未恢復(fù)至正常水平（圖3A、B）。在左側(cè)腎臟動(dòng)靜脈夾閉30 min的單腎模型中，可以看到腎臟功能在術(shù)后24 h雖也有明顯的增高，但與干細(xì)胞治療組無明顯的差別，在第2天肌酐及尿素氮明顯下降，與雙腎夾閉模型相似直到術(shù)后第7天仍未恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。同時(shí)在雙側(cè)腎臟夾閉模型中小鼠體質(zhì)量及生存率的變化，在模型組中術(shù)后小鼠的體質(zhì)量明顯下降，隨著時(shí)間的延長，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)但至術(shù)后第7天仍未恢復(fù)至術(shù)前，干細(xì)胞治療組小鼠體質(zhì)量仍在術(shù)后第1天有明顯的下降，但隨著時(shí)間的延長體質(zhì)量較模型組較快的恢復(fù)，至術(shù)后第7天體質(zhì)量幾乎恢復(fù)至術(shù)前（圖3C），但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組小鼠至術(shù)后第7天只有50%的生存率（圖3D），而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療明顯提高小鼠生存率（P=0.02）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞光鏡、流式細(xì)胞結(jié)果Fig.1 MSCs Phenotype and flowcytometricanalysis

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在雙側(cè)腎臟及脾臟的分布Fig.2 The numbers of MSCs recruited to kidney and spleen

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療減輕腎臟病理的改變建立左側(cè)腎臟夾閉30 min的單側(cè)腎臟缺血再灌注模型，在術(shù)后24 h注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在術(shù)后3、5、7 d處死小鼠，腎臟病理經(jīng)HE染色。急性缺血再灌注腎損傷病理存在明顯的腎小管損傷，病理表現(xiàn)包括腎小管上皮細(xì)胞渾濁腫脹，出現(xiàn)水樣或空泡變性，刷狀緣消失，部分腎小管上皮細(xì)胞凝固性壞死、脫落，腔內(nèi)可見蛋白管形，并可見間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)可見灶性炎細(xì)胞浸潤（圖4）。本實(shí)驗(yàn)顯示在術(shù)后第3、5天干細(xì)胞注入明顯減輕腎臟病理損傷（P＜0.05）。

圖3 不同組不同時(shí)間腎臟功能、體質(zhì)量及存活率的變化Fig.3 Serum creatinine，BUN，mortality and the body weight in I/R modal during the time

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)模型組及干細(xì)胞治療組腎臟病理HE染色Fig.4 Histological findings tested by HE-stained in two groups at different time

2.5 干細(xì)胞注入促進(jìn)細(xì)胞增生并減少管周毛細(xì)血管的丟失在術(shù)后3、5、7 d處死小鼠制成冰凍切片，使用KI67染色標(biāo)記增生細(xì)胞，CD31標(biāo)記管周毛細(xì)血管。隨著時(shí)間的延長增生細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖5A-H），在術(shù)后第3天干細(xì)胞的注入明顯促進(jìn)細(xì)胞再生（P＜0.01）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯減少管周毛細(xì)血管丟失（圖5I-P），特別是在術(shù)后第3天明顯減少管周毛細(xì)血管丟失（P＜0.01）。

圖5 干細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞增生減少管周毛細(xì)血管丟失Fig.5 MSCs promote proliferation of cells and attenuate PTC loss

3 討論

急性腎損傷及慢性腎臟病急性加重病死率高達(dá)50%。FRIEDENSTEIN等［3］在世界上首次分離培養(yǎng)了骨髓干細(xì)胞。目前已有越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道干細(xì)胞的注入成為治療多種疾病的良好方法其中也包括多種急慢性腎臟疾?。?-6］。骨髓干細(xì)胞具有多向分化潛能、容易培養(yǎng)、擴(kuò)增等優(yōu)勢，與胚胎干細(xì)胞相比不存在倫理問題。本實(shí)驗(yàn)即應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞觀察其是否可以促進(jìn)急性腎損傷的修復(fù)。

在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)培養(yǎng)的干細(xì)胞具有典型的梭形形態(tài)，并進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測的方法證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞特異性表達(dá)CD73、CD90細(xì)胞分子標(biāo)記，證實(shí)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過尾靜脈注入的方法注入到模型鼠體內(nèi)，免疫熒光顯示干細(xì)胞特異性被招募到受損的腎臟，并隨著損傷的減輕干細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而未受損的右側(cè)腎臟干細(xì)胞數(shù)量較少，證實(shí)招募為特異性。在雙側(cè)腎臟缺血再灌注模型中結(jié)果顯示干細(xì)胞注入可以提高小鼠生存率、促進(jìn)小鼠體質(zhì)量的增加，促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)，進(jìn)一步腎臟病理結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入明顯減少腎臟病理的損傷。為進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腎臟修復(fù)的機(jī)制，本研究將腎臟冰凍切片行KI67及CD31染色，結(jié)果證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯促進(jìn)細(xì)胞增生，并明顯減輕管周毛細(xì)血管的丟失。腎臟急性缺血損傷主要導(dǎo)致近端腎小管損傷，但目前有實(shí)驗(yàn)顯示嚴(yán)重的急性腎損傷致長期缺血可以導(dǎo)致管周毛細(xì)血管的丟失可進(jìn)一步加重腎小管損傷并促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)展，管周毛細(xì)血管丟失進(jìn)一步導(dǎo)致受傷區(qū)域血流量的減少，使得氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)輸入減少進(jìn)一步導(dǎo)致慢性缺血，促進(jìn)腎小管增生及減輕管周毛細(xì)血管的丟失都有助于腎臟功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過增加細(xì)胞再生及減輕管周毛細(xì)血管的丟失促進(jìn)缺血再灌注腎損傷的修復(fù)，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床再次提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)也存在一定的不足，檢測指標(biāo)仍較為單一，且目前有研究證實(shí)干細(xì)胞注入體內(nèi)長時(shí)間可轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞［7］，為干細(xì)胞治療腎臟病的安全性提出了重要課題，本實(shí)驗(yàn)的研究時(shí)間尚短，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。