楊媛媛 王文莙 王瀟飛 曹相玫 黃允寧 馬艷梅 徐遠(yuǎn)義

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系（銀川750004）；2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科（銀川750001）

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡主要原因之一［1］。胃癌患者表現(xiàn)為“三低三高”的特征，即早期診斷率、根治性切除率與五年生存率低，發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率與死亡率高。局部擴(kuò)散與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌治療失效與預(yù)后不良的首要原因［2］。胃癌細(xì)胞異常增殖、侵襲與遷移是胃癌擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。因此，識(shí)別胃癌細(xì)胞在異常增殖、侵襲與遷移過(guò)程的特異性分子標(biāo)志物，研發(fā)針對(duì)特定分子異常的靶向治療藥物是胃癌治療亟需解決的難題。

腹腔種植轉(zhuǎn)移是胃癌患者最常見(jiàn)的復(fù)發(fā)形式。本研究所采用的藥物硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）具有腹腔吸收慢、作用時(shí)間久、毒副作用少等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種具有研究潛力與研究?jī)r(jià)值的抗癌藥物［3］。前期研究已經(jīng)證實(shí)DS能夠有效減少胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移［4］并且DS能夠抑制不同分化程度的人胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力［5］。然而，涉及具體信號(hào)通路的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

最近的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）與其下游靶基因血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并且與腫瘤的增殖、侵襲與遷移過(guò)程關(guān)系密切相關(guān)［6］。目前，Nrf2/HO-1信號(hào)通路活化在胃癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用尚未明確。因此，以Nrf2、HO-1為靶點(diǎn)的相關(guān)研究，對(duì)胃癌治療具有重要意義。

本研究模擬體內(nèi)胃癌缺氧微環(huán)境，在低氧條件下培養(yǎng)人胃癌BGC-823細(xì)胞，觀察DS對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲與遷移能力的影響，檢測(cè)DS作用前后Nrf2、HO-1的表達(dá)變化，探討DS抑制腹腔種植轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制，旨在為DS的后續(xù)研究與臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，也為胃癌的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人胃低分化腺癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥品與試劑DS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司；青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自北京索萊寶公司；兔單克隆抗體Nrf2、小鼠單克隆抗體HO-1均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠單克隆抗體β-Tubulin購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自北京中杉金橋公司；全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京普利萊公司；Nrf2、HO-1與GAPDH引物序列由上海生工公司設(shè)計(jì)合成；總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥品處理人胃癌BGC-823細(xì)胞復(fù)蘇后使用含10%FBS與1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)開(kāi)始傳代培養(yǎng)，2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，3 d進(jìn)行一次傳代。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞備檢，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。稱取適量DS溶解于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，混勻后經(jīng)22 μm過(guò)濾器滅菌，使用前用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為0.3%。

1.2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)收集上述細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至103個(gè)/mL，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，米字方向輕輕晃動(dòng)，盡量使細(xì)胞分散均勻。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別加入PBS與DS，24 h后更換完全培養(yǎng)基，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至10 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色后，流水緩慢洗去染液，觀察克隆并拍照，計(jì)算各組中細(xì)胞克隆形成數(shù)量。

1.2.3 Transwell侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)稀釋基質(zhì)膠鋪于小室上室。待基質(zhì)膠凝固后，收集上述細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，接種于小室上室。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，上室更換相應(yīng)的干預(yù)培養(yǎng)基，下室添加含F(xiàn)BS的常規(guī)培養(yǎng)基，置于37℃、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。輕柔擦棄上室細(xì)胞與基質(zhì)膠，經(jīng)4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野拍照，計(jì)算各組中穿膜細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需鋪膠，余同侵襲實(shí)驗(yàn)制備。

1.2.4 免疫細(xì)胞熒光收集上述細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，接種于細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2、8、12、24 h。細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100通透20 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗反應(yīng)4℃過(guò)夜，二抗反應(yīng)37℃30 min，滴加DAPI工作液，封片。Nrf2用FITC標(biāo)記，HO-1用羅丹明標(biāo)記，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件，在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，獲得所選視野的平均光密度值。

1.2.5 Western Blot收集上述細(xì)胞，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，數(shù)量為2×106個(gè)細(xì)胞/皿。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2、8、12、24 h。應(yīng)用全蛋白提取試劑盒收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞蛋白裂解液，劇烈震蕩30 s，冰上孵育4 min，重復(fù)5個(gè)循環(huán)，14 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液為全蛋白提取物。應(yīng)用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。100℃加熱10 min。配膠、上樣、進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)、ECL顯影。應(yīng)用Image J圖像分析軟件測(cè)量條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Q-PCR收集上述細(xì)胞，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，數(shù)量為2×106個(gè)細(xì)胞/皿。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2、8、12、24 h。應(yīng)用總RNA提取試劑盒收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞RNA裂解液，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板合成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。Nrf2引物，F(xiàn)：5′-AACACAAGTCCCAGTGTGGC-3′，R：5′-TGCCCCTGAGATGGTGACAA-3′，擴(kuò)增片段為194 bp。HO-1引物，F(xiàn)：5′-GGCCTCCCTGTACCACATCT-3′，R：5′-CTGCATGGCTGGTGTGTAGG-3′，擴(kuò)增片段為 184 bp。GAPDH引物，F(xiàn)：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，R：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，擴(kuò)增片段為138 bp。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△CT方法計(jì)算對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用IBM SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯減少，并且形成的克隆體積較小、染色較淺，差異具有顯著性（P＜0.01，圖1）。結(jié)果表明，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖能力。

2.2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2C），結(jié)果表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的遷移能力。

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2D），結(jié)果表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞Nrf2、HO-1表達(dá)的影響采用免疫熒光雙染分別標(biāo)記Nrf2與HO-1。結(jié)果顯示，Nrf2的表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯減弱，2、8、12、24 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜ 0.01、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖3B）。HO-1的表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯減弱，2、8、12、24 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜ 0.05、P8＜ 0.01、P12＜0.01、P24＜0.01，圖3C）。同時(shí)可觀察到Nrf2與HO-1存在共定位現(xiàn)象，共定位集中于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。并且，隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Nrf2、HO-1的熒光強(qiáng)度逐漸增加。

2.5 Western Blot檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823 細(xì)胞Nrf2、HO-1表達(dá)的影響采用Western Blot檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在低氧條件下培養(yǎng)2、8、12、24 h后人胃癌BGC-823細(xì)胞中Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Nrf2的蛋白表達(dá)量隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，尤其以12、24 h增加最為顯著。同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜ 0.05、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖4B）。HO-1的表達(dá)量隨低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量在2 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＞0.05），在8、12、24 h顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P8＜0.05、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖4C）。結(jié)果表明，Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)水平隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞中Nrf2、HO-1的表達(dá)。

圖2 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組人胃癌BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲能力Fig.2 Transwell invasion and migration assay were used to detect the invasive ability and migration ability of human gastric cancer BGC-823 cells in the control group and the experimental group，respectively

圖3 免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)Fig.3 Immunofluorescence assay was used to detect the protein expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

圖4 Western Blot檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)Fig.4 Western Blot assay was used to detect the protein expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

2.6 Q-PCR檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞Nrf2、HO-1表達(dá)的影響采用Q-PCR檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在低氧條件下培養(yǎng)2、8、12、24 h后人胃癌BGC-823細(xì)胞中Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Nrf2的mRNA表達(dá)量隨低氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)量明顯降低，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異存在顯著性（P2＜ 0.01、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖5A）。HO-1的表達(dá)量隨低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量在2 h略有減少（P2＞ 0.05），在8、12、24 h明顯減少，差異存在顯著性（P8＜ 0.05、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖5B）。

圖5 Q-PCR檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)Fig.5 Q-PCR assay was used to detect the mRNA expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

3 討論

早期胃癌的治療多以外科手術(shù)為主，手術(shù)后輔以化學(xué)藥物治療，而對(duì)進(jìn)展期或中晚期的胃癌以化學(xué)藥物治療為主［7］。普通的化療藥物在腹腔容易被吸收，導(dǎo)致藥物在腹腔停留時(shí)間過(guò)短不能達(dá)到很好的治療作用。本研究中采用的DS屬于大分子右旋糖苷衍生物，相對(duì)分子質(zhì)量為5×105，正因其分子量較大使之在腹腔吸收緩慢，作用時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，腹腔腫瘤細(xì)胞持續(xù)暴露于高濃度藥物中而大大提升化療效果。

課題組前期通過(guò)體內(nèi)研究證實(shí)，DS能夠減少裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量、體積與瘤內(nèi)血管生成［4］；體外研究證實(shí)DS能夠抑制不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1的增殖、侵襲與遷移［5］?；谇捌谘芯炕A(chǔ)筆者推測(cè)DS能夠通過(guò)改善腫瘤內(nèi)微環(huán)境、減少腫瘤血管生成、降低腫瘤細(xì)胞生物活性等方面抑制胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移，然而具體的分子機(jī)制尚不明確。微環(huán)境是一個(gè)功能單元，能夠與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的相互作用［8］。由于腫瘤的快速生長(zhǎng)和相關(guān)的血管功能不全導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的O2供應(yīng)與消耗速率之間不平衡。缺氧是胃癌微環(huán)境的一個(gè)重要病理生理特征［9］。本研究旨在胃癌缺氧微環(huán)境下探討DS對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的作用及其可能的分子機(jī)制。

胃癌細(xì)胞具有活躍的增殖、侵襲與遷移能力，這種能力使胃癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。胃癌患者多處于進(jìn)展期往往已存在局部轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究為了觀察DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響，首先采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS干預(yù)前后細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果顯示，DS干預(yù)后細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著減少，說(shuō)明DS能夠顯著抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖能力。隨后，為了觀察DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，筆者又采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)DS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力與遷移能力的影響。侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，DS干預(yù)后穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的侵襲能力與遷移能力。以上結(jié)果表明，DS能夠有效抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移。

腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與遷移是一個(gè)動(dòng)態(tài)連續(xù)的復(fù)雜過(guò)程，受多個(gè)分子通路及其之間復(fù)雜的交互作用所調(diào)控。Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子Cap‘n′Coall（CNC）家族的成員，主要參與激活與細(xì)胞適應(yīng)以及細(xì)胞保護(hù)相關(guān)的基因表達(dá)。通常Nrf2以無(wú)活性狀態(tài)位于細(xì)胞質(zhì)中，因與細(xì)胞質(zhì)中的伴侶蛋白Keap1結(jié)合活性受到抑制。一旦細(xì)胞處于氧化應(yīng)激反應(yīng)，Keap1就會(huì)從Nrf2中解離，失去抑制Nrf2活性的能力。此時(shí)Nrf2易位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，從而激活各種細(xì)胞保護(hù)蛋白基因的表達(dá)，其中以HO-1表達(dá)水平的提高最為明顯［10］。HO-1是Nrf2的依賴性細(xì)胞反應(yīng)的主要效應(yīng)物之一［11］。HO-1是血紅素分解代謝過(guò)程中的起始酶與限速酶，它能夠催化血紅素降解產(chǎn)生膽紅素、一氧化碳（CO）和游離鐵（Fe2+），這些物質(zhì)具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用［12］。

Nrf2與HO-1所形成的Nrf2/HO-1信號(hào)通路，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激保護(hù)機(jī)制［13］。正常生理狀態(tài)下，Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活有利于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)性。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明Nrf2與其轉(zhuǎn)錄的靶基因的潛在致癌作用。Nrf2、HO-1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6］。進(jìn)一步的研究表明，Nrf2、HO-1在腫瘤細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。Nrf2的高表達(dá)誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，反之Nrf2的敲低抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。并且Nrf2通過(guò)下調(diào)HO-1抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖［14］。人結(jié)腸癌細(xì)胞中Nrf2敲低抑制了異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)［15］。HO-1的過(guò)表達(dá)增加了小鼠黑色素瘤細(xì)胞的活力與增殖，并降低了荷瘤小鼠的存活率［16］。

Nrf2、HO-1不僅參與細(xì)胞增殖，而且還參與細(xì)胞侵襲與遷移。Nrf2可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的重塑，使其有利于癌細(xì)胞的自主入侵和遷移［17］。Nrf2還可通過(guò)氧化應(yīng)激相關(guān)分子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Nrf2表達(dá)的下調(diào)能夠減少細(xì)胞的侵襲與遷移［18］。HO-1的高表達(dá)增加了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲與遷移［19］。此外，Nrf2及其靶蛋白HO-1參與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞遷移［20］。目前，Nrf2/HO-1信號(hào)通路活化與胃癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究很少，其在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用尚不明確。因此，Nrf2、HO-1可能是胃癌診斷與治療的潛在分子標(biāo)志物。

本研究在低氧條件下培養(yǎng)人胃癌BGC-823細(xì)胞不同時(shí)間后，采用免疫細(xì)胞熒光、Western Blot檢測(cè)DS干預(yù)前后Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1的表達(dá)量隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，尤其以12、24h增加最為顯著。提示低氧能夠誘導(dǎo)Nrf2、HO-1高表達(dá)，并且這種表達(dá)具有時(shí)間依賴性。Nrf2、HO-1的表達(dá)水平與低氧培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，反映胃癌缺氧微環(huán)境能夠促進(jìn)Nrf2、HO-1的表達(dá)，提示Nrf2、HO-1與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Nrf2、HO-1在胃癌中表達(dá)上調(diào)這與Nrf2、HO-1被證實(shí)在其他不同類型腫瘤中表達(dá)上調(diào)［6］結(jié)果一致。與此同時(shí)，同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量降低，表明DS可以持續(xù)作用并顯著抑制Nrf2、HO-1的表達(dá)。Nrf2、HO-1表達(dá)趨勢(shì)的變化幾乎是同步的，提示Nrf2對(duì)HO-1表達(dá)的重要調(diào)節(jié)作用。因此，筆者推測(cè)DS可能直接作用于Nrf2，通過(guò)抑制Nrf2依賴性HO-1表達(dá)，從而抑制胃癌增殖、侵襲與遷移。為了進(jìn)一步明確DS作用的分子機(jī)制，筆者采用Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相同條件下人胃癌BGC-823細(xì)胞中Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與免疫細(xì)胞熒光、Western Blot檢測(cè)結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，其機(jī)制可能是DS通過(guò)作用于Nrf2進(jìn)而對(duì)HO-1的表達(dá)產(chǎn)生影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，本研究結(jié)果不能完全排除DS作用于Nrf2/HO-1信號(hào)通路上游靶點(diǎn)或者其他信號(hào)通路影響人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的可能。后續(xù)研究將構(gòu)建Nrf2基因過(guò)表達(dá)或沉默載體繼續(xù)深入探討DS對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的調(diào)控作用與作用效果。

綜上所述，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的能力，并下調(diào)Nrf2、HO-1的表達(dá)。本研究有望為DS的后續(xù)研究與臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，也為胃癌的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。