賈蟬憶 毛凌 郭立榮 陳遠壽 韓勇

遵義醫(yī)學院1生理教研室，2形態(tài)學實驗室（貴州遵義563000）

慢性心力衰竭早期表現(xiàn)為心肌代償性肥厚，心肌肥大的持續(xù)發(fā)展將引發(fā)心律失常、心肌梗死等危險癥狀，目前針對心肌肥大發(fā)生的分子機制尚未完全闡明［1］。多種病理因素可導致心肌肥大的發(fā)生，其中血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）在心肌肥大進程中發(fā)揮了重要作用。AngⅡ可通過誘發(fā)活性氧簇（ROS）生成、誘導線粒體功能紊亂等機制參與心肌肥大以及心衰的發(fā)生、發(fā)展［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，機體另外一種內源性活性物質——20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）在心肌肥大中發(fā)揮重要作用。如在異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥大中，20-HETE合成酶CYP4A/4F表達增高，抑制20-HETE生成可顯著降低心肌肥大［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE可誘導心肌細胞內ROS生成以及導致線粒體功能紊亂［4］，表明20-HETE具有與AngⅡ所誘導的心肌肥大相同的信號作用機制。然而，20-HETE是否通過如上機制參與AngⅡ誘導心肌肥大，目前尚無報道。因此，本研究目的主要是探究在H9c2心肌細胞中，20-HETE是否通過誘導心肌細胞內過量ROS生成以及線粒體功能紊亂等機制，參與AngⅡ誘導的心肌細胞肥大進程中，為闡明AngⅡ依賴性心血管疾病的細胞、分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器AngⅡ和Fluo-3/AM鈣離子探針（Sigma公司，美國），HET0016（Cayman公司，美國），DHE試劑盒和草酸銨結晶紫染液（索萊寶公司，中國），JC-1熒光探針及BCA試劑盒（上海碧云天公司，中國），MitoSOX Red線粒體超氧化物指示劑（翊圣生物，中國），NADPH氧化酶活性測定試劑盒（南京建成生物制品公司，中國），逆轉錄試劑盒及熒光SYBR GreenⅠ（TaKaRa公司，日本），RNA引物合成（上海捷瑞公司，中國），大鼠抗CYP4A抗體（Santa Cruz公司，美國），β-actin及HRP標記二抗（Proteintech公司，美國），20-HETE ELISA檢測試劑盒（Detroit R＆D公司，美國）。激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國），酶標儀及CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）。

1.2 H9c2心肌細胞培養(yǎng)及分組H9c2心肌細胞株購自中國科學院上海細胞庫，完全培養(yǎng)基37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞試驗。細胞隨機分為4組：對照組，AngⅡ組（1 μmol/L），AngⅡ+HET0016組（10 μmol/L），HET0016組（10 μmol/L），各加藥組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。

1.3 心肌細胞表面積及蛋白濃度檢測多聚甲醛固定心肌細胞，草酸銨結晶紫染液染色，鏡下觀察，Image J1.48軟件分析測量。細胞內總蛋白濃度采用BCA法按說明書操作，酶標儀595 nm波長測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.4 心鈉肽（ANP）及腦鈉肽（BNP）基因表達Trizol提取細胞RNA，按逆轉錄試劑盒操作說明書合成cDNA。引物序列：ANP 125 bp上游：5′-CGGACAAAGGCTGAGAGAGAAAC-3′，下游：5′-AAAAGGCCAGGAAGAGGAAGAAG-3′；BNP 105 bp，上游：5′-GACAAGAGAGAGCAGGACACCAT-3′，下游 ：5′-TAAGGAAAAGCAGGAGCAGAATCAT-3′；GADPH 84 bp，上游：5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′；下游：5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。反應條件為：預變性94℃、30 s；變性94℃、5 s；退火60 ℃、30 s；共40個循環(huán)，2-ΔΔCt法分析結果。

1.5 ROS及線粒體超氧化物含量檢測細胞清洗后，DHE（10 μmol/L）染色，激光共聚焦顯微鏡激發(fā)波長535 nm、發(fā)射波長610 nm條件下，檢測紅色熒光強度反應細胞內ROS含量。通過MitoSox Red染液（5 μmol/L）染色法檢測線粒體內超氧化物，激發(fā)波長510 nm、發(fā)射波長580 nm，LAS AF Lite 2.6軟件分析熒光強度。

1.6 NADPH氧化酶活性檢測細胞蛋白提取液（1 mg/mL）加入細胞色素C（500 μmol/L）和NADPH（100 μmol/L）孵育，酶標儀550 nm波長下檢測吸光值，超氧化物歧化酶SOD（200 U/mL）作為吸光值矯正。

1.7 線粒體膜電位（ΔΨm）檢測細胞清洗后，JC-1熒光探針（10 μg/mL）避光孵育，激光共聚焦顯微鏡下觀察。正常ΔΨm在激發(fā)波長585 nm、發(fā)射波長590 nm下產生紅色熒光；ΔΨm降低時，在激發(fā)波長514 nm、發(fā)射波長529 nm下產生綠色熒光，LAS AF Lite2.6軟件分析紅色熒光強度與綠色熒光強度比值。

1.8 CYP4A蛋白表達及20-HETE含量測定提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，Western blot法檢測CYP4A蛋白表達，β-actin為內參，Image J 1.48軟件分析。超聲波破碎心肌細胞后，乙酸乙酯萃取，氮氣吹干，按ELISA說明書操作，酶標儀450 nm波長處測量OD值，應用ELISA Calc1.0軟件，根據(jù)標準曲線回歸方程計算20-HETE含量。

1.9 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t方法檢驗統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HET0016抑制AngⅡ誘導的心肌肥大作用AngII處理后顯著增加了H9c2心肌細胞表面積、細胞內蛋白濃度以及ANP和BNP基因的表達。HET0016共孵育后，顯著抑制了AngⅡ誘導的心肌肥大作用，細胞表面積由（2 084.7±74.3）μm2降至（2 777.9±134.5）μm2（P＜0.05），蛋白濃度由（4.02±0.20）mg/mL下降至（3.00±0.36）mg/mL。ANP、BNP的mRNA表達分別降低了22.3%和26.7%（圖1、表1，P＜0.05）。

2.2 HET0016減少AngⅡ誘導的ROS生成及抑制NADPH氧化酶活性增高如圖2A所示，AngⅡ顯著增加了細胞內DHE熒光強度，HET0016處理后DHE熒光強度由74.48±8.04降至39.08±5.29（P＜0.05）。圖2B結果表明，與對照組相比，AngⅡ組NADPH氧化酶活性明顯增高1.78倍，HET0016顯著阻斷了AngⅡ的作用（P＜0.05）。

圖1 AngII對H9c2心肌細胞表面積的影響及HET0016的作用Fig.1 Effects of AngII on the surface area of H9c2 cells and the role of HET0016

表1 AngII對H9c2心肌細胞蛋白濃度及ANP、BNP表達的影響及HET0016的作用Tab.1 Effects of AngII on total protein concentration，ANP and BNP mRNA expression in H9c2 cells and the role of HET0016x±s

2.3 HET-0016阻斷AngⅡ誘發(fā)線粒體內超氧化物生成及膜電位（ΔΨm）下降如圖3A所示，AngⅡ誘導的線粒體超氧化物生成是對照組的4.09倍，而HET0016處理后顯著抑制了AngⅡ的作用（P＜0.05）。圖3B結果表明，與對照組相比，AngⅡ組ΔΨm顯著下降了56.2%，而使用HET0016共孵育后顯著抑制了AngⅡ誘導的ΔΨm下降（P＜0.05）。

2.4 AngⅡ促進CYP4A表達及20HETE含量增加如圖4A所示，AngⅡ組心肌細胞內CYP4A蛋白表達與對照組相比顯著升高1.55倍（P＜0.05）；圖4B結果表明，與對照組相比AngⅡ組細胞內20-HETE含量明顯增加68.8%，HET0016處理后顯著阻斷了AngⅡ誘發(fā)的20-HETE含量增多（P＜0.05）。

圖2 HET0016對AngⅡ誘導的ROS及NADPH氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of HET0016 on AngⅡ-induced intracellular ROS level and NADPH oxidase acitvity

圖3 HET0016對AngⅡ誘導的線粒體內ROS生成及ΔΨm水平的影響Fig.3 Effects of HET0016 on AngⅡ-induced mitochondrial ROS production and ΔΨm level

3 討論

20-HETE是CYP4A/4F酶催化花生四烯酸生成的活性物質，近年研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE具有誘導心肌細胞凋亡以及心肌肥大作用［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)20-HETE可誘發(fā)心肌細胞內ROS生成增多、導致線粒體功能紊亂［4］，這與AngⅡ誘導心肌肥大的機制類似。同時，前期本課題組還報道了20-HETE可介導AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡。但是，20-HETE是否參與AngⅡ誘導的心肌肥大，目前尚無報道。本研究中發(fā)現(xiàn)，應用20-HETE合成酶抑制劑——HET0016處理后，顯著阻斷了AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞肥大作用，首次觀察到20-HETE在AngⅡ誘導心肌肥大進程中發(fā)揮重要作用，但其中機制尚待進一步探究。

有研究表明，AngⅡ可通過激活NADPH氧化酶誘導心肌細胞內ROS生成，導致心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與AngⅡ作用類似，20-HETE同樣具有激活心肌細胞內NADPH氧化酶誘導ROS生成作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷20-HETE生成可顯著抑制AngⅡ誘導的NADPH氧化酶活性增強以及ROS生成增多效應，提示20-HETE可通過NADPH氧化酶依賴機制增加ROS生成從而參與AngⅡ誘導的心肌肥大中。

研究發(fā)現(xiàn)，肥厚型心肌病患者出現(xiàn)線粒體腫脹、膜電位（ΔΨm）下降等現(xiàn)象，ΔΨm下降可引起線粒體呼吸鏈解耦聯(lián)，誘發(fā)更多超氧化物釋放，形成細胞內ROS生成的惡性循環(huán)［6］。研究表明，AngⅡ誘發(fā)ROS生成、引起ΔΨm下降導致線粒體功能紊亂是其誘導心肌肥大的重要機制［7］。與此研究一致，本研究中發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ處理的H9c2心肌細胞中ΔΨm明顯下降，而HET0016共孵育處理后，一方面抑制了AngⅡ誘導的線粒體內超氧化物的生成，另一方面也顯著阻斷了AngⅡ引起的ΔΨm下降。如上結果表明，20-HETE通過引起線粒體功能紊亂的機制介導了AngⅡ誘導的心肌細胞肥大效應，提示減少20-HETE的生成可有效保護AngⅡ對線粒體功能的影響，從而抑制AngⅡ誘導的心肌肥大的發(fā)生。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與20-HETE均具有刺激心肌細胞內鈣離子濃度升高作用［8-9］，而AngⅡ通過升高細胞內鈣離子濃度從而激活calcineurin-NFAT信號通路是其誘導心肌肥大的重要機制［9］，那么，20-HETE是否也與AngⅡ共享該通路從而參與其誘導的心肌肥大，有待進一步探究。

在血管系統(tǒng)以及腎臟中，AngⅡ可通過AT1受體的激活促進20-HETE生成，生成的20-HETE可介導AngⅡ收縮血管效應以及升高血壓作用［5］。此外，在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中，AngⅡ可通過促進20-HETE生成誘導細胞凋亡［6］。本研究在H9c2心肌細胞中同樣發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理后CYP4A表達顯著增加，并促進20-HETE生成，后者介導了AngⅡ誘導的心肌肥大。這些研究提示，在多種器官組織中，AngⅡ具有促進20-HETE生成作用，同時20-HETE可介導AngⅡ的生物學效應，這為闡明AngⅡ依賴性的高血壓以及相關心血管疾病的細胞、分子機制提供了新思路。