艾文偉 張明 雷夢覺 胡杰 孟哲 高登峰

江西省人民醫(yī)院二部1心內(nèi)二科，2心內(nèi)一科（南昌330006）；3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科（西安710004）

過去的二十年中，越來越多的研究表明：慢性炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起到了舉足輕重的作用；炎性細(xì)胞富集、炎癥因子釋放和脂質(zhì)氧化堆積均伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生［1-2］。巨噬細(xì)胞以及由巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成的泡沫細(xì)胞在斑塊內(nèi)聚集是包括人類在內(nèi)的哺乳動物血管內(nèi)粥樣斑塊的主要病理改變［3］。因此，減少巨噬細(xì)胞的遷入和泡沫細(xì)胞的生成將明顯減緩粥樣斑塊的形成。

Toll樣受體是一組高度保守的病原模式識別受體，其對免疫和炎癥反應(yīng)具有多樣的調(diào)節(jié)作用，因此在天然免疫過程中起到關(guān)鍵作用，而Toll受體4（TLR4）是這一家族的重要成員之一［4］。TLR4主要分布于包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞在的內(nèi)多種免疫細(xì)胞［5］；當(dāng)其與內(nèi)毒素（LPS）等特異性配體結(jié)合后，可上調(diào)NF-κB（p65）等轉(zhuǎn)錄因子，增加多種炎癥因子的表達(dá)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)［6-8］。在動脈粥樣硬化等多種疾病中，血管、心臟等靶器官內(nèi)TLR4的表達(dá)明顯增加，提示以TLR4主導(dǎo)的天然免疫過程可能部分參與了上述病變的發(fā)展過程［9］?？驳厣程故桥R床常用的AT1受體拮抗劑，臨床用于治療高血壓［10］、糖尿病腎?。?1］以及慢性心功能衰竭［12］。已有研究提示坎地沙坦可抑制LPS誘導(dǎo)的腦及脾臟炎癥反應(yīng)［13-14］；減少斑塊面積［15］。本研究旨在探尋坎地沙坦對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響及機(jī)制，以期拓展改善動脈粥樣硬化進(jìn)程的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑坎地沙坦（日本W(wǎng)ako公司），RPMI1640完全培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胎牛血清（北京transgen公司）及real-time RT-PCR試劑盒（北京transgen公司），四氮唑藍(lán)（MTT）和內(nèi)毒素（LPS）（美國Sigma公司），TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒（美國BioSource International公司），兔抗鼠TLR4、髓樣分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）和β-actin抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）。

1.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于完全RPMI1640培養(yǎng)液中，含12%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）。37℃下置于5%CO2培養(yǎng)箱中，傳代至4～6代后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞分為5組：對照組、LPS干預(yù)組、LPS+坎地沙坦10-7mol/L、LPS+坎地沙坦10-6mol/L和LPS+坎地沙坦10-5mol/L。LPS的濃度為500 ng/mL。

1.4 細(xì)胞活性測定采用MTT比色法測定細(xì)胞活性［16］。

1.5 實(shí)時定量PCR檢測TLR4、MyD88和NF-κB（p65）mRNA的表達(dá)按4×105個/孔將細(xì)胞接種于6孔板，含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至70%～80%融合，無血清培養(yǎng)基孵育12 h。不同濃度坎地沙坦無血清培養(yǎng)基孵育1 h后，加入LPS（500 ng/mL）刺激4 h，用Trizol試劑（北京Transgen公司）提取各組總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Transgen公司，北京）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.6 免疫印跡檢測TLR4、MyD88和NF-κB（p65）蛋白的表達(dá)細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)至80%～90%融合。換用無血清培養(yǎng)基12 h。后以不同濃度坎地沙坦孵育1 h，加入LPS刺激9 h，RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測條帶，Quantity one軟件行圖像分析。

1.7 ELISA測定白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平細(xì)胞接種于96孔板，不同濃度坎地沙坦孵育1 h，加入LPS刺激24 h，收集各孔中上清液。ELISA試劑盒測定IL-1β和TNF-α濃度。自動酶聯(lián)免疫吸附儀在450 nm處讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此計(jì)算各組定IL-1β和TNF-α濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用單因素方差分析，多重均數(shù)比較使用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 坎地沙坦對細(xì)胞活性的影響見表1，濃度在10-8～10-4mol/L范圍內(nèi)時，坎地沙坦對RAW264.7細(xì)胞活性無顯著影響。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用10-7～10-5mol/L濃度的坎地沙坦進(jìn)行進(jìn)一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 坎地沙坦對 TLR4、MyD88及 NF-κB（p65）mRNA表達(dá)的影響LPS刺激4 h后，可明顯上調(diào)TLR4、MyD88及NF-κB（p65）的mRNA表達(dá)?？驳厣程诡A(yù)處理1 h后，再給予相同濃度LPS刺激，與LPS刺激組比較，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性降低（圖1）。提示坎地沙坦可有效抑制TLR4炎癥通路的激活。

2.3 坎地沙坦對TLR4、MyD88及NF-κB（p65）蛋白表達(dá)的影響500 ng/mL LPS刺激9 h后，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的蛋白表達(dá)明顯上升?？驳厣程诡A(yù)處理1 h后，再給予相同濃度LPS刺激9 h，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的蛋白表達(dá)較LPS組明顯下降，并呈劑量依賴性（圖2）。提示坎地沙坦可抑制TLR4通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)。

2.4 坎地沙坦對IL-1β和TNF-α分泌的影響LPS刺激24 h后，細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌明顯增加。不同濃度坎地沙坦預(yù)處理可呈劑量依賴性降低IL-1β和TNF-α濃度（圖3）。

圖1 坎地沙坦對RAW264.7細(xì)胞TLR4、MyD88及NF-κB（p65）mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of candesartan on the mRNA expression of TLR4，MyD88 and NF-κB（p65）in LPS-stimulated RAW264.7 cells

圖2 坎地沙坦對RAW264.7細(xì)胞TLR4、MyD88及NF-κB（p65）蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of candesartan on the protein expression of TLR4，MyD88 and NF-κB（p65）in LPS-stimulated RAW264.7 cells

圖3 坎地沙坦對IL-1β和TNF-α分泌的影響Fig.3 Effects of candesartan on the expression of IL-1β and TNF-α in LPS-stimulated RAW264.7 cells

3 討論

研究表明，Toll樣受體可調(diào)控天然免疫、抗原呈遞和獲得性免疫等多個免疫和炎癥環(huán)節(jié)，而這些作用主要是通過控制細(xì)胞因子表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)的［6］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余個Toll樣受體家族成員，均可通過與TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子（TIRAP）/Myd88結(jié)合，將外源性信號傳入胞內(nèi)，從而促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子及膜表面分子的合成［17］。TLRs參與了粥樣硬化斑塊發(fā)生、成熟和最終破裂的各個發(fā)展階段，通過多重效應(yīng)促進(jìn)斑塊的形成和易損性［18-20］。與配體結(jié)合后，TLRs可通過Myd88依賴的信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位，繼而上調(diào)IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)；亦可能通過非Myd88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而增加干擾素分泌。上述途徑在促進(jìn)斑塊的形成和易損性中起重要作用［21］。研究表明，人及動物模型的粥樣斑塊組織內(nèi)TLR4的表達(dá)明顯升高［19］；高脂飲食的TLR4基因敲除小鼠動脈粥樣斑塊體積顯著減?。煌瑫r穩(wěn)定性增強(qiáng)［22］。提示TLR4及其下游通路的激活是粥樣硬化疾病進(jìn)展的一個重要促進(jìn)因素。

本研究重點(diǎn)聚焦于TLR4及其下游通路的激活，及由此引發(fā)的炎癥因子釋放和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大。在給與單核細(xì)胞LPS刺激后，TLR4/Myd88 mRNA水平明顯升高，NF-κB（p65）合成增加。NF-κB由P65和P50二聚體組成，活化的NF-κB隨即從胞漿向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，與DNA上的靶向序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游多個因子的活化。因此NF-κB二聚體的激活已被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路之一［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予巨噬細(xì)胞LPS刺激后，TLR4及Myd88表達(dá)明顯增加；伴隨NF-κB（p65）合成增加，下游IL-1β和TNF-α的分泌顯著升高。以上結(jié)果說明Myd88依賴性TLR4信號通路的激活參與了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的過程。

血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑（ARB）類藥物被廣泛用于原發(fā)性高血壓、糖尿病腎病及慢性心功能不全等疾病［11-13］。多項(xiàng)試驗(yàn)證實(shí)：ARB類藥物通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和改善內(nèi)皮功能等機(jī)制，能夠有效地減輕高糖誘發(fā)的心肌炎癥反應(yīng)［24］，抑制內(nèi)膜增生和減少平滑肌增殖等［25］。慢性心功能不全和高血壓患者接受坎地沙坦治療一段時間后，其血漿中C反應(yīng)蛋白、白介素-6（IL-6）及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子水平明顯下降［25］。坎地沙坦能夠有效抑制LPS誘發(fā)的小鼠腎上腺炎癥反應(yīng)［15］；通過降低TLR4通路激活，調(diào)節(jié)天然免疫減輕LPS引起的小鼠脾臟炎癥反應(yīng)［27］。本研究中坎地沙坦可以有效降低巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)；抑制Myd88依賴性TLR4通路的激活；減少NF-κB依賴性炎癥因子的釋放。巨噬細(xì)胞在粥樣硬化發(fā)病過程中的重要作用早已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)同，而TLR4又在巨噬細(xì)胞膜表面高表達(dá)。因此，筆者推測坎地沙坦通過對巨噬細(xì)胞TLR4炎癥通路的抑制，應(yīng)該能夠起到延緩粥樣斑塊形成的作用。本研究能為坎地沙坦在粥樣硬化疾病治療方面的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。