何丹,朱坪,劉林,江成浩,劉譽澤,陳禎勇

610041 成都,四川大學華西醫(yī)院西藏成辦分院 普外科

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占所有甲狀腺癌的85%～90%[1]。近30年來由于高分辨超聲及細針穿刺學不斷發(fā)展，全球大多數(shù)地區(qū)PTC的發(fā)病率逐年上升，我國亦呈上升趨勢[2]，其中以直徑≤1cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)為主[3]。盡管多數(shù)PTC，尤其是PTMC預(yù)后良好，但既往研究中仍有部分PTMC存在局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4-5]，甚至有發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移致死亡的報道。因此，如何鑒別具有侵襲性生物學行為的PTMC，對其進行最佳臨床處理尚存挑戰(zhàn)。BRAFV600E突變作為PTC最常見的基因突變形式，發(fā)生率約25%～82.3%。近期兩項Meta分析結(jié)果顯示，BRAF基因突變與PTC患者的腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及TNM分期有關(guān)[6-7]。但目前關(guān)于BRAF基因突變與PTMC的侵襲性是否相關(guān)尚缺乏共識[8-10]。本次研究通過搜集我科近3年住院的西藏PTMC患者，探究BRAFV600E基因突變與腫瘤侵襲性的關(guān)系，明確BRAFV600E是否可作為評估PTMC腫瘤生物學行為的分子標志，以期對PTMC患者提供最佳治療策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年5月～2017年5月在我院就診行手術(shù)治療的69例PTMC患者的臨床資料及病理組織，所有患者術(shù)前檢測抗甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體水平，明確是否合并橋本氏甲狀腺炎。術(shù)后均經(jīng)病理證實為乳頭狀癌，并明確是否合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。本組病例男性5人(7.2%)，女性64人(92.8%)；年齡29～67歲，平均年齡47歲，其中<45歲33例(47.8%)，≥45歲36例(52.2%)；腫瘤直徑≤5mm 29例(42.0%)，>5mm 40例(58.0%)。

1.2 BRAFV600E基因檢測方法

將石臘塊切成10mm石臘切片，經(jīng)脫蠟、消化組織蛋白、去除RNA后，用核酸提取柱提取基因組DNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法檢測BRAFV600E基因 (人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒：廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；檢測設(shè)備：ABI steponeplus 熒光定量PCR儀)，按試劑盒說明書利用 FAM基團標記的Taqman探針對擴增產(chǎn)物進行分析，若FAM通道有典型的S型擴增曲線升起，且Ct值≤32判斷為樣本BRAFV600E基因突變陽性；若無典S型擴增曲線升起，或Ct值大于32，則判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，頻數(shù)的比較采用χ2檢驗。以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理特征及BRAFV600E基因突變檢測結(jié)果

69例PTMC中，46例為單發(fā)腫瘤(66.7%)，腫瘤呈多灶者23例(33.3%)；存在腺外侵犯21例(30.4%)；TNM分期按AJCC 2010版標準執(zhí)行，T1期患者48例(69.6%)，T3期19例(27.5%)，T4期2例(2.9%)；術(shù)后病理證實存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例(23.2%)，其中2例伴有頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；所有患者均未檢測出遠處轉(zhuǎn)移；臨床分期I期患者54例(78.3%)，III/IV期15例(21.7%)；合并結(jié)節(jié)性腺腫18例(26.1%)，合并橋本甲狀腺炎15例(21.7%)。42例樣本檢出BRAFV600E基因突變，基因突變率為 60.9%，詳見表1。

表1 69例PTMC患者臨床病理資料及BRAFV600E基因突變

Table 1. Clinicopathologic Data and BRAFV600EMutations in 69 PTMC Patients

VariableNo. of patientsPercentage(%)Sex Male57.2 Femal6492.8Age <45yrs3347.8 ≥45yrs3652.2Tumor size(mm) ≤52942.0 >54058.0Muliple foci No4666.7 Yes2333.3

(Table 1 continues on next page)

(Continued from previous page)

VariableNo. of patientsPercentage(%)Extrathyroid invasion No4869.6 Yes2130.4T stage T14869.6 T31927.5 T422.9Lymph node metastases No5376.8 Yes1623.2Clinical stage I5478.3 III-IV1521.7Nodular goite No5173.9 Yes1826.1Hashimoto thyroiditis No5478.3 Yes1521.7BRAFV600E mutation No2739.1 Yes4260.9

2.2 BRAFV600E基因突變與PTMC臨床病例特征的關(guān)系

BRAFV600E基因突變與PTMC患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。BRAFV600E基因突變與腫瘤多灶性、腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系經(jīng)χ2檢驗有統(tǒng)計學意義。BRAFV600E基因突變陽性組，多灶腫瘤(P=0.036)、腺外侵犯(P=0.024)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率(P=0.013)、III/IV期腫瘤患者構(gòu)成比(P=0.021)要高于BRAFV600E基因突變陰性組，差異有統(tǒng)計學意義。(表2)

表2 BRAFV600E基因突變與PTMC患者臨床病理特征的關(guān)系

Table 2. Correlation between BRAFV600EMutation and Clinicopathologic Characteristics of PTMC Patients

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PSex-0.073? Male41 Female2341Age2.0690.150 <45 yrs1023 ≥45 yrs1719Tumor size(mm)0.0300.862 ≤51118 >51624

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PMuliple foci4.3810.036 No2224 Yes518Extrathyroid invasion5.1120.024 No2325 Yes417Lymph node metastases6.2020.013 No2528 Yes214Clinical stage5.3550.021 I2529 III-IV213

*Fisher’s exact test

2.3 BRAFV600E基因突變與PTMC有無伴隨病變的關(guān)系

69例PTMC中，合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫18例，BRAFV600E基因突變率72.2%，不合并者51例，基因突變率56.9%，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.251)；合并橋本氏甲狀腺炎15例，BRAFV600E基因突變率為46.7%，不合并者54例，基因突變率為64.8%，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.203)，詳見表3。

表3 BRAFV600E突變狀態(tài)與PTMC伴隨病變的關(guān)系

Table 3. Correlation between BRAFV600EMutation and PTMC-associated Lesions

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PNodular goite1.3180.251 No2229 Yes513Hashimoto thyroiditis1.6230.203 No1935 Yes87

2.4 PTMC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征的關(guān)系

69例患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為23.2%，除BRAFV600E基因突變陽性外，存在腫瘤多灶性、腺外侵犯患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均顯著增高(P<0.001)；而不同性別、年齡、腫瘤直徑以及有無伴發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、橋甲炎各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床病理特征

Table 4. Clinicopathologic Characteristics Associated with Lymph Node Metastases

VariableLymph nodemetastasesNoYesχ2PMuliple foci41.660<0.001 No460 Yes716Extrathyroid invasion25.405<0.001 No453 Yes813BRAFV600E mutation6.2020.013 Negative252 Positive2814

3 討 論

PTMC并不都是不進展的亞臨床狀態(tài)，任何晚期PTC都是由PTMC進展而來。Guerra等[11]認為PTMC包含兩個亞型：一部分生物學性質(zhì)呈惰性，甚至終生無癥狀；另一部分可能合并高侵襲性組織學類型，在就診時存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者術(shù)后發(fā)現(xiàn)隱匿性頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，某些甚至在早期就出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。 因此，如何評估PTMC生物學行為，判斷是否存在侵襲性，對臨床治療決策尤為重要。

BRAFV600E基因突變作為PTC最常見的突變形式，通過激活絲裂原活化的蛋白激酶信號通路，引起細胞不斷增殖、腫瘤形成[12-13]，參與甲狀腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。2015版美國甲狀腺學會指南將BRAFV600E基因納入了PTC復(fù)發(fā)風險分層，但對于直徑≤1cm腫瘤并未明確提及。目前關(guān)于BRAFV600E基因突變與PTMC侵襲性的相關(guān)性仍具有爭議。有研究顯示，BRAFV600E突變與PTMC不良預(yù)后無必然聯(lián)系[9]。但也有研究報道PTMC 不完全等同于低危 PTC，其兩者生物學行為類似，不應(yīng)被輕視[14]。

PTMC中BRAFV600E基因突變檢出率可能由于樣本來源、檢測技術(shù)、病理學家操作水平、人種等種種原因存在差異。Ma等[15]學者通過對19篇原始研究進行系統(tǒng)評價發(fā)現(xiàn)BRAFV600E基因突變率為37.5%～71.7%，平均突變率為50.7%。此外，同歐美國家比較，東方人群中BRAFV600E基因突變發(fā)生率較高。本研究中藏族人群PTMC BRAFV600E基因突變率為60.9%，與國內(nèi)學者張金蘋等[16]的報道一致。

本研究顯示PTMC患者BRAFV600E基因突變與性別、年齡、腫瘤大小、合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及橋本氏甲狀腺炎無明顯相關(guān)性，與既往研究報道基本一致[17]。本次研究結(jié)果證實PTMC患者BRAFV600E基因突變與腫瘤多灶性明顯相關(guān)，與某些國外學者的研究存在差異[18]，這可能與樣本量，檢測方法不同有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯、腫瘤TNM分期(III/IV期)作為評價腫瘤侵襲性臨床病理特征，可預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、進展。既往報道在PTMC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為6%～66%[19]，本研究中藏族患者PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率23.2%，其中14例存在BRAFV600E基因突變；此外，BRAFV600E基因突變還與腫瘤腺外侵犯、進展期PTMC相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(表2)。因此藏族人群中存在BRAFV600E基因突變的PTMC表現(xiàn)出更具侵襲性的生物學行為。此研究結(jié)果與國內(nèi)一些學者基于漢族人群的研究結(jié)果一致，部分PTMC可能合并高侵襲性組織學類型[20]。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高對患者不良預(yù)合有明顯影響，而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是外科醫(yī)師選擇術(shù)式的關(guān)鍵。雖然術(shù)前彩超可評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，但由于檢測設(shè)備及操作人員的差別，檢測結(jié)果可能存在假陰性，此為術(shù)后腫瘤迅速復(fù)發(fā)的主要原因之一。國內(nèi)學者梁發(fā)雅[21]對117例cN0的PTMC患者行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，術(shù)后病檢提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約30%。而實施預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃可增加總并發(fā)癥及低鈣血癥的發(fā)生[22]。本次研究將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為因變量進行分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E基因突變、腫瘤多灶性、腺外侵犯明顯相關(guān)，表明這些臨床病理因素可以預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，這與Liu等[23]學者的薈萃分析結(jié)果一致。因此，對PTMC患者行術(shù)前影像學檢查聯(lián)合BRAFV600E基因檢測可以指導(dǎo)PTMC患者初次手術(shù)方案的制定，對是否行預(yù)防性淋巴結(jié)清掃提供依據(jù)。

綜上所述，藏族人群中PTMC患者BRAFV600E基因突變較為多見，且PTMC并非都是低危腫瘤，與腫瘤多灶、侵襲、轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，可作為篩選高危PTMC患者的分子標記，評估預(yù)后并指導(dǎo)個體化治療。但PTMC發(fā)生發(fā)展過程是否有其他分子事件參與，仍需進一步研究。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應(yīng)責任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。