茍小霞，阮培剛，徐穎，王彥哲，徐暉，曾令秀，張貴海

553003貴州 遵義，遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 頭頸腫瘤科

近幾年來(lái)，隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，研究者們?cè)絹?lái)越趨向于將細(xì)胞和組織生物學(xué)表達(dá)譜數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于各大數(shù)據(jù)庫(kù)中，并依賴于科學(xué)的信息理論、方法和技術(shù)來(lái)查詢、管理、分析和利用生物分子的數(shù)據(jù)，找到其中的差異變化，以制定最佳的臨床治療。其中，Oncomine是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)；迄今為止，該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，包含86 733個(gè)樣本的芯片結(jié)果，擁有最全的臨床預(yù)后資料[1]。腦膠質(zhì)瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，各種治療手段的效果均不佳，患者預(yù)后極差[2]。為此，我國(guó)于2007年啟動(dòng)了基于中國(guó)人群的中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)，現(xiàn)已完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序600多例[3]，以期利用數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘潛在的腫瘤基因，分析基因的功能，探索基因在腫瘤中的表達(dá)情況并進(jìn)行臨床預(yù)后的相關(guān)分析，從而找到新的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵限速酶，參與細(xì)胞能量代謝，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)過(guò)程。NAMPT在多種實(shí)體瘤包括結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌組織中明顯升高，且與患者生存和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)[4]。本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘NAMPT在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，提取CGGA膠質(zhì)瘤生存數(shù)據(jù)分析其表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究NAMPT在膠質(zhì)瘤中的意義奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

篩選條件如下：①“Cancer Type: Brain and CNS Cancer”;②“Gene：NAMPT”；③“Data Type：all”;④“Sample Type: Clinical Specimen”;⑤“Analysis Type: Cancer vs．Normal Analysis”;⑥臨界值設(shè)定條件Pvalue<1×10-4，fold change>2, gene rank=top 10%.

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

膠質(zhì)瘤病例組與癌旁正常組織之間NAMPT表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)。NAMPT表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NAMPT在所有腫瘤類型中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了有關(guān)NAMPT的研究結(jié)果共426項(xiàng)，在設(shè)定的搜索條件下表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果有43項(xiàng)，其中NAMPT表達(dá)增高的有 24項(xiàng)，表達(dá)降低的有19項(xiàng)，且主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)直腸癌等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)增高的研究有8項(xiàng)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤6項(xiàng)，間變星形細(xì)胞瘤1項(xiàng)，間變少突細(xì)胞瘤1項(xiàng);沒(méi)有表達(dá)降低的研究(表1)。

表1 NAMPT在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中所有腫瘤相關(guān)研究中的表達(dá)

Table 1. Up-regulated and Down-regulated Expression of NAMPT in Studies from Oncomine Database

Type of cancerUp-regulated(n)Down-regulated(n)Bladder cancer -1Brain and CNS cancer 8-Breast cancer-2Cervical cancer--Colorectal cancer7-Esophageal cancer-2Gastric cancer --Head and neck cancer--Kidney cancer4-Leukemia -8Liver cancer -2Lung cancer -1Lymphoma 22Melanoma--Myeloma--Ovarian cancer--Pancreatic cancer --Prostate cancer--Sarcoma-1Other cancers3-

2.2 NAMPT在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況

我們發(fā)現(xiàn)在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，從2001年起共有10項(xiàng)研究涉及NAMPT在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的mRNA水平表達(dá)。文章分別發(fā)表于Journal of clinical oncology[5],Cancer Cell[6],Oncogene[7],Cancer research[8],Cancer Cell[9],TCGA(數(shù)據(jù)未發(fā)表),Cancer research[10-12]。Meta分析顯示，與癌周正常的腦組織相比較，膠質(zhì)瘤組織中NAMPT呈高表達(dá)(P<0.001)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 NAMPT在膠質(zhì)瘤mRNA水平的過(guò)表達(dá)情況

Table 2. Detailed Information of NAMPT Expression in Glioma

Data (n)Study objectFold ChangetPMurat, Brain(84) [5]Glioblastoma vs normal3.13711.329<0.001Lee, Brain(101) [6]Glioblastoma vs normal6.72810.895<0.001Shai, Brain(42) [7]Glioblastoma vs normal3.0736.191<0.001Bredel, Brain(54) [8]Glioblastoma vs normal4.6858.398<0.001Sun, Brain(180) [9]Glioblastoma vs normal3.80310.732<0.001Sun, Brain(180) [9]Anaplastic astrocyma vs normal3.7874.372<0.001TCGA, Brain(557) ?Glioblastoma vs normal7.50818.420<0.001French, Brain(33) [10]Anaplastic oligodendroglioma vs normal2.6014.717<0.001Rickman, Brain(51) [11]Astrocytoma vs normal2.3324.221<0.001Gutmann, Brain(15) [12]Pilocytic astrocytoma vs normal1.8702.1050.034

*Data unpublished

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中NAMPT在膠質(zhì)瘤研究中的匯總表達(dá)情況

Figure 1. The NAMPT Expression of Glioma in Studies from Oncomine Database

Thefigureindicates10meta-analysesofNAMPTgeneexpression.ThecoloredsquaresrepresentthemedianofNAMPTcomparedtonormaltissuein10studies.ThePvalueforageneisitsPvalueforthemedian-rankedanalysis.

2.3 NAMPT在不同類型腦膠質(zhì)瘤芯片中癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異

我們分別選擇星形細(xì)胞瘤[11]、間變星形細(xì)胞瘤[9]、間變少突細(xì)胞瘤[10]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(數(shù)據(jù)未發(fā)表)中樣本量最大的研究進(jìn)行分析。在這4項(xiàng)研究中，NAMPT在不同類型腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織(均P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.4 NAMPT表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

NAMPT在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高，為了進(jìn)一步明確NAMPT表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系，我們?cè)贑GGA數(shù)據(jù)庫(kù)[2-3]提取WHO病理分級(jí)為II級(jí)，包括星形細(xì)胞瘤60例、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤18例、少突細(xì)胞瘤37例，III級(jí)包括間變性星形細(xì)胞瘤9例、間變性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤9例、間變性少突細(xì)胞瘤17例，IV級(jí)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤106例。分為NAMPT高表達(dá)組及低表達(dá)組，通過(guò)Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，在II級(jí)膠質(zhì)瘤中，高、低表達(dá)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在III級(jí)膠質(zhì)瘤中，高表達(dá)組預(yù)后差于低表達(dá)組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.197)；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，高表達(dá)組預(yù)后明顯差于低表達(dá)組(P=0.014)(見(jiàn)圖3)。

圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中NAMPT在不同類型膠質(zhì)瘤芯片中的表達(dá)情況

Figure 2. Expression of NAMPT in Different Glioma Chips from Oncomine Database

ThePvalueislowerthan0.001.Thefoldchangeisdefinedas2.(A)ExpressionofNAMPTinastrocytomaandnormaltissue; (B)ExpressionofNAMPTinanaplasticastrocytomaandnormaltissue; (C)ExpressionofNAMPTinanaplasticoligodendrogliomaandnormaltissue; (D)ExpressionofNAMPTinglioblastomaandnormaltissue.

圖3 NAMPT表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

Figure3.RelationshipbetweenExpressionofNAMPTandSurvivalTimeofPatientswithGlioma

A. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with grade II gliomas; B. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with grade III gliomas; C. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with glioblastoma.

2.5 NAMPT的GO和Pathway注釋

基因本體論(Gene Ontology)簡(jiǎn)稱GO，現(xiàn)已成為生物信息學(xué)領(lǐng)域中用于功能富集分析的一個(gè)重要方法和工具。GO注釋包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分三個(gè)部分。通過(guò)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索NAMPT參與的生物學(xué)過(guò)程包括有NAD代謝補(bǔ)救途徑、非脂肪組織發(fā)育、細(xì)胞與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、晝夜節(jié)律調(diào)控、非胰島素受體信號(hào)通路、正向調(diào)控細(xì)胞增殖、正向調(diào)控RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。其分子功能有細(xì)胞因子活性、藥物結(jié)合、蛋白結(jié)合、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性等(表3)。通過(guò)Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索NAMPT參與的Pathway有調(diào)節(jié)時(shí)鐘基因的表達(dá)、維生素代謝、煙堿代謝等(表4)。

表3 NAMPT在NCBI中的GO分析

Table 3. GO Analysis of Expressed NAMPT in NCBI

Gene nameBiological ProcessMolecular functionCellular componentNAMPTSignal transductionCytokine activityCell junctionNOT adipose tissue developmentDrug bindingCytosolCell-cell signalingIdentical protein bindingExtracellular exosomeCircadian regulation of gene expressionProtein bindingNuclear speckCircadian rhythmProtein homodimerization activityFemale pregnancyNicotinamide phosphoribosyl transferase activityNOT insulin receptor signaling pathwayPositive regulation of cell proliferationPositive regulation of nitricoxide synthase biosynthetic processPositive regulation of transcription from RNA polymerase II promoterRegulation of receptor activityResponse to organic cyclic compoundNAD biosynthesis via nicotinamide riboside salvage pathway

表4 NAMPT在Reactome中的Pathway注釋

Table 4. Pathway Annotation of Expressed NAMPT in Reactome

Gene namePathwayNAMPTCircadian clock(BMAL1:CLOCK,NPAS2 activates cir-cadian gene expression) Metabolism of vitamins and cofactorsMetabolism of water-soluble vitamins and cofactorsNicotinate metabolismNicotinamide salvaging

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤。根據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類，膠質(zhì)瘤可分為WHOⅠ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，I、II級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，III、IV級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤[13]。膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以放療、化療、靶向治療等綜合治療。目前高級(jí)別膠質(zhì)瘤治療后的預(yù)后較差，間變性膠質(zhì)瘤患者的中位生存時(shí)間為2～3年，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存時(shí)間僅1年[14]。由于高級(jí)別膠質(zhì)瘤侵襲性高，即使經(jīng)過(guò)手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后給予替莫唑胺同步放化療或替莫唑胺輔助化療，仍有大多數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā)[15]。因此尋找新的小分子靶向化療藥物顯得十分重要。

惡性增殖的腫瘤細(xì)胞需要源源不斷的能量和代謝底物來(lái)維持生物大分子合成和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[16]。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞主要依賴糖酵解途徑獲得三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為自身快速增殖和生存提供能量[17]。此外，糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的大量中間代謝產(chǎn)物，可作為脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的合成原料，而乳酸進(jìn)入間質(zhì)后可以維持酸性微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)及參與腫瘤代謝重編程。因此，腫瘤細(xì)胞對(duì)糖酵解途徑重要輔酶NAD的需求量較正常細(xì)胞明顯增高。研究顯示，腫瘤細(xì)胞通過(guò)主要補(bǔ)救合成途徑獲得 NAD，而NAMPT是該途徑的關(guān)鍵限速酶[18]。NAMPT在結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑素瘤等腫瘤中高表達(dá)[19]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系[20]。Lucena等[21]報(bào)道NAMPT 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與Nanog和CD133的表達(dá)成正相關(guān)；Meta分析顯示，NAMPT在啟動(dòng)腫瘤干細(xì)胞通路中起到重要作用。Zhao等[22]研究發(fā)現(xiàn)NAMPT在黑色素瘤中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后有關(guān)，而沉默NAMPT能降低NAD+代謝水平和抑制細(xì)胞增殖，通過(guò)NAMPT-E2F2-SIRT1信號(hào)軸介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞對(duì)P53依賴的凋亡產(chǎn)生抵抗，可作為黑色素瘤的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。這些研究提示，NAMPT影響著惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

我們通過(guò)對(duì)Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的深入分析，發(fā)現(xiàn)NAMPT在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、腎癌及其他腫瘤中高表達(dá)，在乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、軟組織肉瘤中低表達(dá)。10項(xiàng)關(guān)于膠質(zhì)瘤組織在mRNA水平的Meta分析顯示，NAMPT在膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)(P<0.001)。從中選取樣本量最大的4項(xiàng)研究進(jìn)行分析，NAMPT在星形細(xì)胞瘤、間變星形細(xì)胞瘤、間變少突細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)量均明顯高于正常組織(均P<0.01)。通過(guò)CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取WHO II級(jí)115例、III級(jí)35例及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤106例。從生存曲線可以發(fā)現(xiàn)，病理級(jí)別越高，患者預(yù)后越差。在II級(jí)膠質(zhì)瘤中，高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在III級(jí)膠質(zhì)瘤中，高表達(dá)組的預(yù)后差于低表達(dá)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.197)，這可能是因?yàn)榭偛±龜?shù)較少(35例)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)研究。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，高表達(dá)組預(yù)后明顯差于低表達(dá)組(P=0.014)，這與Gujar等[23]的報(bào)道一致。通過(guò)GO和Pathway分析，NAMPT參與NAD代謝補(bǔ)救途徑、細(xì)胞與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、晝夜節(jié)律調(diào)控、胰島素受體信號(hào)通路、細(xì)胞增殖、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程，這為進(jìn)一步深入研究NAMPT機(jī)制提供了方向。

綜上所述，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤相關(guān)基因的深入分析，我們初步發(fā)現(xiàn)NAMPT在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中高表達(dá)；并且，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，NAMPT高表達(dá)的患者預(yù)后更差。CGGA收集的是我國(guó)人群膠質(zhì)瘤的芯片數(shù)據(jù)，更具有中國(guó)人群代表性。應(yīng)用NAMPT抑制劑或許能夠抑制 NAMP酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi) NAD 的水平，減緩細(xì)胞能量代謝的速度而具有抗腫瘤作用[24]。因此，NAMPT可能是腫瘤治療的新靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

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