劉雨霞， 鄭 菊， 張文萍， 李 毅， 吳昌學(xué)， 齊曉嵐， 官志忠， 肖 雁*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

血管性癡呆(VaD)被廣泛認(rèn)為是除阿爾茨海默病外的第二種癡呆類型，其臨床表現(xiàn)主要為神經(jīng)認(rèn)知障礙，包括行為癥狀和運動異常[1]。缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷是引起VaD的主要原因，其機制主要包括炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。線粒體作為細(xì)胞呼吸和能量產(chǎn)生的中心細(xì)胞器，也是缺血再灌注損傷的靶細(xì)胞器[2]，眾多研究表明當(dāng)缺血再灌注發(fā)生時，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體功能受到損傷[3-4]，因此及時消除受損或功能失調(diào)的線粒體被認(rèn)為是在氧糖剝奪再灌注(oxygen and glucose deprivation，OGD/R)中保護(hù)細(xì)胞免受缺血應(yīng)激的必要條件[5]。線粒體自噬是由自噬選擇性清除線粒體的過程，線粒體自噬可以識別并去除異常線粒體，維持線粒體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，線粒體蛋白中Beclin1、P62的表達(dá)水平能很好地反應(yīng)胞內(nèi)線粒體自噬的活性[6]。本研究對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞體外構(gòu)建不同時間的OGD/R模型，觀察OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧 (reactive oxygen species, ROS)含量、線粒體蛋白Beclin1及P62表達(dá)變化，探討不同時間OGD/R對SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

1.1.1細(xì)胞及試劑 SH-SY5Y細(xì)胞購自美國典型菌種保藏庫(american type culture collection，ATCC，貨號ATCC ? CRL-2266TM)。試劑DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基、無糖DMEM、澳洲胎牛血清、0.25%胰酶消化液(購自美國Gibco公司)，Beclin1抗體購自美國Abcam公司，SQSTM1/P62抗體購自美國CST公司，COXⅣ抗體購自美國CST公司，HRP標(biāo)記的抗兔二抗購自美國CST公司，BCA蛋白定量試劑、ECL-Plus發(fā)光液購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ROS檢測試劑盒購自北京貝博公司，JC-1流式試劑盒購自美國BD公司，細(xì)胞線粒體提取分離試劑盒購自碧云天生物試劑公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.1.2儀器 ELX800UV酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tec公司)，Western blot跑膠裝置電源(北京百晶科技公司)，Varioskan LUX多通道酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，GeneGnome XRQ 化學(xué)發(fā)光成像儀(英國SYNGENE公司)，F(xiàn)ACS Verse 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將完全培養(yǎng)基、血清及雙抗按89∶10∶1的比例制成工作培養(yǎng)基，取凍存SH-SY5Y細(xì)胞懸液1 mL、工作培養(yǎng)基10 mL加入透氣蓋培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，次日換液。培養(yǎng)3～5 d時進(jìn)行傳代，待第二代細(xì)胞均勻鋪滿瓶底的80%時，取1.5×106/孔細(xì)胞于6孔板中；待第三代SH-SY5Y細(xì)胞處于對數(shù)生長期時對細(xì)胞進(jìn)行OGD/R。根據(jù)剝奪及再灌注的時間不同，將細(xì)胞分為5組：control組(不作OGD/R)、3 h/12 h組(氧糖剝奪3 h后再灌注12 h)、3 h/24 h組(氧糖剝奪3 h后再灌注24 h)、6 h/12 h組(氧糖剝奪6 h后再灌注12 h)、6 h/24 h組(氧糖剝奪6 h后再灌注24 h)。

1.2.2SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R模型的制備 每99 mL無糖DMEM中加入1 mL雙抗，制成1%雙抗的無糖培養(yǎng)基。取處于對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪：棄去板內(nèi)工作培養(yǎng)基，1×PBS洗3次(1 min/次)，每孔加入無糖培養(yǎng)基2 mL，將六孔板置于37 ℃、5%CO2、94%N2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行氧糖剝奪(對照組與3 h/24 h組共同換液，每次換液后用1×PBS洗后每孔加入工作培養(yǎng)基2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng))，剝奪相應(yīng)時間(3 h或6 h)后棄去無糖培養(yǎng)基，1×PBS洗3次(1 min/次)，換工作培養(yǎng)基2 mL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)進(jìn)行再灌注，時間分別為12 h或24 h。

1.2.3細(xì)胞線粒體膜電位檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)，每只JC-1凍干粉加入DMSO溶解125 μL成JC-1儲存液，JC-1儲存液與1×Assay Buffer按99∶1的比例配置JC-1工作液；陽性對照用CCCP稀釋1 000倍處理細(xì)胞20 min。OGD/R后用0.25%不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞，每孔取1×106個細(xì)胞，1×PBS洗1次，用JC-1工作液0.5 mL懸浮細(xì)胞，放入37 ℃、5%培養(yǎng)箱中孵育15 min，孵育完畢后加入1×Assay Buffer 2 mL洗滌，1 500 r/min離心5 min，1×Assay Buffer洗滌2次后去除多余探針，將細(xì)胞沉淀重懸于0.5 mL的 1×Assay Buffer中，吹打重懸細(xì)胞，用40 μm過濾網(wǎng)篩除去細(xì)胞團塊及JC-1顆粒物質(zhì)，上機檢測。

1.2.4細(xì)胞ROS含量測定 采用流式細(xì)胞術(shù)，用完全培養(yǎng)基按1∶1 000比例稀釋DCFH-DA探針， OGD/R后的細(xì)胞用不含EDTA胰酶消化、離心收集細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞，陰性對照(blank)直接用0.5 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，其余組將細(xì)胞沉淀重懸于1 mL稀釋的DCFH-DA探針中，放入37 ℃、5%培養(yǎng)箱中孵育20 min(為使探針與細(xì)胞更好接觸，每4 min顛倒混勻1次)；用1 mL完全培養(yǎng)基洗3次(分別1 500 r/min離心5 min)，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針。最終用完全培養(yǎng)基0.5 mL吹打重懸細(xì)胞，用40 μm過濾網(wǎng)篩除去細(xì)胞團塊及JC-1顆粒物質(zhì)，即刻上機檢測，平均熒光強度表示ROS含量。

1.2.5SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Beclin1、P62蛋白表達(dá) 采用Western blot方法，OGD/R后的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，冰浴1×PBS洗1次，2 000 r/min，4 ℃離心5 min，每管細(xì)胞加入500 μL分離試劑(每1mL線粒體分離試劑臨用前加入PMSF 10 μL)，冰浴15 min后玻璃勻漿器勻漿30次，2 700 r/min，4 ℃離心10 min，取上清9 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，每管沉淀加入線粒體裂解液100 μL(100 μL線粒體裂解液臨用前加入PMSF 1 μL)，冰上放置20 min(每5 min旋渦混勻1次)，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清即為線粒體蛋白。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，每孔取20 μg線粒體蛋白(20 μL)上樣于12%的SDS-PAGE凝膠后進(jìn)行電泳分離，于Gene Gnome XRQ中曝光。COXⅣ作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 OGD/R后線粒體膜電位

細(xì)胞OGD/R相應(yīng)時間后，用JC-1染料標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)評估SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位(MMP，Δψm)變化。如圖1所示，JC-1在正常線粒體內(nèi)形成聚集體，在Q2象限中顯示紅色熒光；當(dāng)線粒體發(fā)生去極化時，JC-1以單體形式存在，表現(xiàn)為Q3象限的綠色熒光。OGD / R后，Q3象限中細(xì)胞的比例增加， JC-1分裂成綠色熒光單體，表現(xiàn)為低膜電位(綠色熒光)的細(xì)胞百分比增加(可反映線粒體膜電位的去極化程度)；半定量分析結(jié)果顯示，與control組比較，SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后線粒體膜電位均發(fā)生去極化(P<0.01)，且3 h/24 h組的線粒體膜電位去極化程度最高。

2.2 OGD/R后細(xì)胞內(nèi)ROS含量

利用DCFH-DA探針標(biāo)記處理相應(yīng)時間的SH-SY5Y細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。如圖2 所示，在胞內(nèi)DCFH-DA被活性氧氧化生成熒光物質(zhì)DCF，OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞熒光增多，表示OGD/R后細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高，用ROS熒光強度表示胞內(nèi)ROS相對含量；半定量結(jié)果顯示，與與control組比較，細(xì)胞OGD/R后胞內(nèi)ROS含量增高(P<0.01)，且再灌注24 h組ROS含量較剝奪相同時間再灌注12 h組高(P<0.01)，且6 h/24 h組ROS含量最高(P<0.01)。

2.3 SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Beclin1及P62蛋白表達(dá)

用線粒體蛋白COX Ⅳ做內(nèi)參，Western bolt檢測各組細(xì)胞線粒體中Beclin1及P62蛋白表達(dá)，以對照組細(xì)胞線粒體中Beclin1及P62蛋白表達(dá)量為對照，觀察各OGD/R組細(xì)胞線粒體蛋白的相對表達(dá)量。如圖3所示：與control組比較， 3 h/24 h組、6 h/12 h組及6 h/24 h組線粒體中Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，且3 h/24 h組較3 h/12 h組更高(P<0.01)；各組P62蛋白表達(dá)比較，3 h/12 h組、3 h/24 h組P62蛋白表達(dá)與對照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

(1)與control組比較P<0.01；(2)與3 h/24 h組比較P<0.01圖1 OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況Fig.1 Changes of mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells after OGD/R

(1)與control組比較，P<0.01；(2)與3 h/24 h組比較，P<0.01；(3)與6 h/24 h組比較，P<0.01圖2 OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況Fig.2 Changes of ROS in SH-SY5Y cells after OGD/R

(1)與control組比較，P<0.01； (2)與3 h/12 h組比較，P<0.01圖3 各組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Beclin1及P62蛋白表達(dá)(Western bolt)Fig.3 Expression of Beclin1 and P62 in mitochondria of SH-SY5Y cells in each group

3 討論

VaD作為最常見的老年期癡呆之一，患病人數(shù)占所有老年癡呆人數(shù)的15%，其發(fā)病率隨中國人口老齡化而逐年升高[7]。腦卒中后缺血缺氧是VaD的常見誘因之一，缺氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激和引發(fā)炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激使血管內(nèi)皮細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞受損，這些病理變化發(fā)生在大腦并導(dǎo)致VaD，其中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷是最主要誘因之一[8]。對SH-SY5Y細(xì)胞系進(jìn)行OGD/R作為缺血性神經(jīng)元損傷快速且靈敏的體外模型已被廣泛用作潛在神經(jīng)保護(hù)劑開發(fā)[9-10]。

線粒體是一種重要的細(xì)胞器，在活細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)能量代謝和ROS生成。在腦卒中后的慢性低灌注可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生功能障礙[11]。缺血再灌注可以阻斷ROS產(chǎn)生與細(xì)胞抗氧化酶的解毒和清除能力之間的穩(wěn)態(tài)，這將引起腦組織內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激激活并進(jìn)一步加重缺血引起的組織損傷[12-13]。同時線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)上的硫醇被氧自由基氧化而誘導(dǎo)開放從而導(dǎo)致線粒體膜電位發(fā)生去極化[14]。有研究發(fā)現(xiàn)在2-VO大鼠中，觀察到線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性降低，線粒體膜電位發(fā)生去極化，同時ROS含量升高[15]，本研究通過對SH-SY5Y細(xì)胞系進(jìn)行OGD/R體外模擬腦卒中患者腦缺血再灌注。通過不同時間的OGD/R探索缺血不同時間段下線粒體功能改變及線粒體自噬程度。從實驗結(jié)果可以看出OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生去極化，且胞內(nèi)ROS含量增加，提示SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后細(xì)胞內(nèi)線粒體功能受損。與YU等[16]的研究結(jié)果，缺血再灌注與神經(jīng)元細(xì)胞線粒體受損有關(guān)，并能引起神經(jīng)元線粒體自噬一致。

OGD/R后，需要有效的清除機制及時清除受損線粒體以保證細(xì)胞狀態(tài)，特別是神經(jīng)元這類細(xì)胞線粒體受損可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的的高活力低再生能力的細(xì)胞更為重要[17-18]。自噬是介導(dǎo)功能障礙線粒體去除的關(guān)鍵細(xì)胞機制之一，是一種囊泡介導(dǎo)的用于受損物質(zhì)的識別、隔離并將其運送至溶酶體進(jìn)行降解并釋放營養(yǎng)物質(zhì)的胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬對受損線粒體的選擇性清除被稱為線粒體自噬，其可以識別并去除異常線粒體維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。但目前仍沒有統(tǒng)一的系統(tǒng)理論來解釋線粒體自噬在腦缺血中的作用，但可能與腦缺血時間及線粒體自噬程度有關(guān)。Beclin1是自噬標(biāo)志性蛋白，在評估自噬發(fā)生程度方面有重要作用[19]，P62又稱為SQSTM1，是一種泛素結(jié)合蛋白，介導(dǎo)線粒體與自噬相關(guān)蛋白的結(jié)合，從而被選擇性的轉(zhuǎn)移到自噬機器中進(jìn)行降解，常用來監(jiān)測自噬的發(fā)生、蛋白底物的清除，以及自噬的抑制等過程[20]。線粒體蛋白中Beclin1、P62的表達(dá)量能很好地反應(yīng)胞內(nèi)線粒體自噬的活性，在本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R后SH-SY5Y線粒體蛋白中Beclin1表達(dá)量升高，3 h/12 h組及3 h/24 h組P62表達(dá)量升高，說明OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬被激活，發(fā)生線粒體自噬，且3 h/24 h組Beclin1表達(dá)量明顯高于3 h/12 h組，說明在某一時間限度內(nèi)，神經(jīng)元線粒體自噬活性隨著氧糖剝奪時間及再灌注時間的增加而升高。

綜上所述，當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生OGD/R時，線粒體功能受到損傷，當(dāng)OGD/R時間超過3 h/24 h時神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬，且在某一時間限度內(nèi)，神經(jīng)元線粒體自噬活性隨著氧糖剝奪時間及再灌注時間增加而升高。