孫鵬霄， 胡洪波， 李 政， 李玉民

(渭南市中心醫(yī)院 骨外科， 陜西 渭南 714000)

椎間盤退化性病變(intervertebral disc degeneration，IVD)是造成下腰痛的主要原因，其病理機制是衰老的髓核(nucleus pulpous，NP)細胞凋亡促進炎性細胞因子的分泌、細胞內免疫細胞的聚集以及細胞外基質的數量減少，同時增加的降解酶會進一步消化細胞外基質組織、合成不足的細胞外基質發(fā)生結構變化容易導致椎間盤的異常負荷，從而進一步導致細胞外基質分解，最終導致椎間盤結構破壞。研究表明，衰老組織中調節(jié)OGA糖基化的酶表達增加，細胞在受到誘導凋亡時，Bcl-2和Bax基因在細胞存活或者死亡中發(fā)揮重要作用[1]；此外，Caspase-3在細胞凋亡的終末途徑中也有重要作用，降低Caspase-3的活性，具有抗凋亡的作用[2-4]。若抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達，增強抗凋亡蛋白Bcl-2表達，則可以通過調節(jié)細胞促凋亡和抗凋亡信號通路平衡，保護細胞。細胞受到損害時，自噬(autophagy)途徑會被激活，自噬信號通路的激活可以起到細胞保護作用[5-7]。若上調自噬蛋白Beclin-1和Lc3B/Lc3A的比值，則可保護細胞，即可通過自噬的自我修復程序降低細胞損傷。而Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關蛋白，是BCL-2基因家族中細胞凋亡促進基因，Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于死亡。關于能否通過調節(jié)NP細胞的OGA來增加NP細胞的保護性自噬，防治衰老誘導的細胞凋亡和椎間盤退行性變的研究尚未見報道。本研究擬通過調節(jié)NP細胞O-GlcNAc糖基化修飾、觀察其對自噬作用調節(jié)，以期為椎間盤退行性變的治療指明新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 實驗選用健康、清潔級成年雄性SD大鼠，體質量250～300 g，符合國家二級實驗動物標準，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司，Ⅱ型膠原酶及胰蛋白酶C購自美國Sigma公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國HyClone公司，單丹磺酰戊二胺(MDC)購自美國Sigma公司，自噬抑制劑購自美國3-MA

1.2 方法

1.2.1大鼠NP細胞的分離和培養(yǎng) 選取12周齡、健康雄性SD大鼠，腹腔注射5%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，將其俯臥位固定、無菌條件下截取SD大鼠胸腰段脊柱組織，在無菌超凈臺提取大鼠椎間盤髓核組織。將髓核組織用組織剪剪碎后加入0.25% Ⅱ型膠原酶消化5 min，采用200目過濾網過濾，收集細胞過濾液進行離心(1 000 g，5 min)，使用含有15%胎牛血清的DMEM-F 12細胞培養(yǎng)液懸浮NP細胞，存放于濃度為5%的CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2 d更換培養(yǎng)液1次，倒置顯微鏡觀察NP細胞形態(tài)學變化，取第二代SD大鼠NP細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2分組 第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞分為對照組和實驗組,對照組為經過壓力培養(yǎng)的第二代SD大鼠NP細胞；實驗組經過壓力培養(yǎng)的NP細胞分別選用氧聯(lián)乙酰葡萄糖胺轉移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和氧聯(lián)乙酰葡萄糖胺水解酶(O-GlcNAcase,OGA)進行干預，再分為OGT組和OGA組。

1.2.3步驟 將生長狀況優(yōu)良的第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞分別接種至24孔板，加0.5 mL培養(yǎng)基，細胞接種密度為1.5×106/cm2，存放于濃度為5%的CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，NP細胞完全貼壁后將NP細胞培養(yǎng)板置入壓力培養(yǎng)裝置中，設為對照組；實驗組中OGT組為在壓力條件下NP細胞培養(yǎng)液內加入O-GlcNAc 促進劑OGT，OGA組加入O-GlcNAc 抑制劑OGA。各組大鼠NP細胞壓力條件下培養(yǎng)時間分別為0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h，每個時間點處取出24孔細胞培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用溫PBS洗滌2次，將濃度0.06 mmol/L MDC 100微升加入24孔板，避光37 ℃條件下孵育20 min，然后用溫PBS洗滌3次。采用流式細胞技術進一步定量分析NP細胞出現自噬空泡細胞的比率及陽性細胞的比例以及NP細胞發(fā)生凋亡的比例，并分析在OGT/OGA作用下細胞存活比例。在0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h各時間點，采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)對NP細胞自噬和凋亡相關基因的表達進行檢測。通過提取各組NP細胞mRNA分別檢測自噬相關基因LC3B、Beclin-1的表達情況和凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2及Bax的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 陽性細胞比例

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時間點進行觀察，可見第二代SD大鼠胸腰段NP細胞內隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，大鼠NP細胞中自噬空泡數量逐漸增加。流式細胞計數結果顯示，對照組和OGA組SD大鼠NP細胞內陽性細胞隨著培養(yǎng)時間延續(xù)，自噬空泡陽性細胞數目逐漸增加，至36 h時達到峰值、48 h后有所減少；與對照組比較，OGA組24 h、36 h及48 h時的陽性細胞比例顯著升高(P<0.05)。見圖1。

(1)與Control組同時點比較，P<0.05圖1 OGA組和對照組第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞自噬空泡細胞比例 Fig.1 The effect of OGA on the percentage of autophagic vacuolar positive cells

2.2 凋亡細胞比例

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時間點進行觀察，可見第二代SD大鼠NP細胞內隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，大鼠NP細胞中凋亡細胞所占比例逐漸增加。流式細胞計數結果顯示，對照組和OGA組SD大鼠NP細胞內凋亡細胞隨著培養(yǎng)時間延續(xù)數目逐漸增加，至48 h時達到峰值。與對照組比較，OGA組24 h、36 h及48 h時的凋亡細胞比例顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 在1 MPa壓力培養(yǎng)條件下SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞凋亡情況Tab.1 Quantitative analysis of of NP cellular apoptosis under pressure culture

2.3 SD大鼠存活的NP細胞

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時間點進行觀察，可見第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)， NP細胞存活比例逐漸下降；流式細胞計數結果顯示，對照組和OGA組NP細胞存活細胞數目逐漸減少，OGA組24 h、36 h及48 h時的存活的NP細胞比例顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 NP細胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1 mRNA表達

在1MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時間點進行實時熒光定量PCR測定OGA組與對照組NP細胞凋亡相關基因表達情況，可見第二代SD大鼠NP細胞內隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，大鼠NP細胞中Bcl-2基因的表達逐漸減少，Caspase-3及BaxmRNA的表達逐漸增多；OGA組與對照組各個時間點比較細胞凋亡相關Bcl-2 mRNA的表達減少幅度顯著，Caspase-3及BaxmRNA的表達增加的幅度顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時間點進行實時熒光定量PCR測定OGT組與對照組NP細胞自噬相關基因表達情況，可見第二代SD大鼠NP細胞內隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，大鼠NP細胞中LC3B與Beclin-1 mRNA的表達逐漸增加(P<0.05)，至36 h時達至峰值，48 h時降低，在12 h及之后各時間點OGT組表達情況均顯著高于對照組(P<0.05)，見表3。

表2 在1 MPa壓力培養(yǎng)條件下SD大鼠胸腰段椎間盤NP細胞存活比例Tab.2 The survival rates of NP cells under pressure culture

表3 大鼠NP細胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1基因表達Tab.3 The mRNA levels of Bcl-2, Bax, Caspas-3, LC3B and Beclin-1

3 討論

IVD是發(fā)生在脊柱的肌肉骨骼疾病，會造成腰背部疼痛和身體殘疾，導致個人生活困難和經濟損失。據調查，椎間盤退變好發(fā)于18～64歲，亦是此類人群去醫(yī)院就診的最常見的原因。在歐美國家，與IVD相關的社會經濟損失估計每年在美國達850億美元，在英國更達到120億英鎊[8-9]。椎間盤位于相鄰的兩片軟骨終板之間, 以中央的NP細胞及周圍的纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)為主要構造。NP細胞為凝膠狀,具有類似減震器的功能，可以將壓力自內向外往周圍的纖維環(huán)和相鄰椎體間釋放分數。NP主要是由Ⅱ型膠原蛋白和彈性蛋白纖維結構而成的一個不規(guī)則的網絡, 這網絡可以將蛋白多糖基質和水分子攏聚在一起。NP內的主要蛋白多糖成分是蛋白聚糖聚合物，這種分子中含有大量的陰離子糖胺聚糖的側鏈，這使得NP得以吸收大量水份從而抵消壓縮載荷。而纖維環(huán)AF由約20個同心環(huán)(片)的高度組織化I型膠原纖維組成，這使其具有最大的拉伸強度。椎間盤也包含其他膠原、蛋白多糖及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，其可給位于NP和AF的細胞提供各種物理和生化信號[10-11]。 NP的細胞外基質成分包括彈性蛋白(elastin)、小分子蛋白多糖及III、VI、IX型膠原和層粘連蛋白[12]，其中某些分子(如VI型膠原蛋白和n-鈣黏著蛋白)可通過NP細胞表面受體與NP細胞相互作用。另外，這些細胞外基質成分還能通過調節(jié)營養(yǎng)物質的運輸、水化和膨脹壓力等方式以機械性方式作用于NP細胞。這些作用被認為對椎間盤的發(fā)展、功能維持、自我修復等過程相當重要，然而，研究人員對這些詳細機制仍知之甚少。研究者普遍認為椎間盤退化性病變是ECM過度代謝的后果。細胞外基質中大分子的降解會導致細胞外基質的結構和成分發(fā)生變化。在椎間盤退化性病變的過程中，NP和AF區(qū)域的細胞密度和細胞集群數量會急劇減少[13]。隨著細胞密度的減小，NP區(qū)域的巨大空泡狀胞漿細胞會轉變?yōu)橐蝗后w積小﹑數目少且獨立分布的軟骨樣細胞[14]。同時，ECM中蛋白多糖基質丟失還能引起ECM結構的變化，從而降低固定負電荷密度和水分含量，導致膨脹壓力的喪失[15]。 NP區(qū)域發(fā)生的這些變化將導致AF承受異常負荷，因而導致ECM發(fā)生進一步分解，最終導致椎間盤結構破壞。NP細胞是軟骨細胞特異性細胞外基質的重要來源。研究表明椎間盤退化性病變起始于NP區(qū)域, NP細胞的過度凋亡是椎間盤退化性病變過程中最重要的結構和生化變化[16-17]。過度凋亡可造成NP細胞數量減少，并導致ECM的合成減少。 ECM分泌不足最終引發(fā)椎間盤退化性病變。因此，預防NP細胞凋亡被認為是減少ECM降解﹑延緩椎間盤退化性病變的最新研究焦點，亦是治療的潛力新途徑。

自噬是一種降解過程, 過程中部分細胞胞漿與溶酶體雙膜囊泡融合形成自噬性溶酶體。這是一種細胞自我保護過程:細胞質通過胞質大分子降解提供富含能量的化合物來進行自我更新，以在外部或內部資源日益減少時滿足細胞的能量需求。這一過程同時也可幫助清除老舊蛋白或受損的蛋白和胞器，即通過回收胞質成分來保持蛋白質和細胞器的質量。因此，自噬在細胞的生長、存活、分化和代謝中起著重要的作用，是細胞一種主要的自我保護作用而不是自我毀滅的過程[18-19]。細胞凋亡和自噬在人體的發(fā)育、生理以及疾病的發(fā)生發(fā)展中都很重要。最近的研究表明，盡管凋亡和自噬間有顯著差異，但它們的調節(jié)卻是密切相關的，而且共享相同的調控機制，因此凋亡和自噬可以互相調節(jié)。例如，細胞自噬伴隨著Bcl-2從Beclin1的釋放，以及FLIP從Atg3的釋放，而自由態(tài)的Bcl-2和FLIP可阻止細胞凋亡[20-21]。從生理的角度來看，自噬對決定細胞死亡是相當重要的，可以通過防止不必要的細胞凋亡來保護細胞[22]。

本研究結果顯示，OGA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進NP細胞自噬過程的發(fā)生，進而對NP細胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用。GA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進NP細胞自噬過程的發(fā)生，進而對NP細胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用。OGA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進NP細胞自噬過程的發(fā)生，進而對NP細胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用，增加NP細胞存活的比例。除了細胞凋亡的調控，自噬也參與調節(jié)炎癥反應。據報道，自噬反應缺陷的Atg16l1基因敲除小鼠對LPS刺激的炎癥反應顯著高于正常對照, 包括caspase1的過度激活和IL-1β的大幅增加[23]。在衰老的過程中，自噬相關基因包括LC3、Beclin1和ULK1在不同的組織中均下調，提示這些組織中自噬作用的減少[24-25]。同時，椎間盤退化性病變過程中自發(fā)產生的炎癥細胞因子增加，這將進一步導致更多的炎性介質釋放并促進椎間盤退化性病變發(fā)展[26]。理論上若提高自噬水平應可阻止細胞凋亡和炎癥反應的發(fā)生。最近，O-GlcNAc糖基化做為蛋白質糖基化修飾的一種形式，也被證明可以調節(jié)自噬。O-GlcNAc糖基化是將單糖分子N-乙酰葡糖胺通過β-糖苷鍵添加到細胞核或細胞質多肽上的絲氨酸或蘇氨酸殘基的一種糖基化過程。 O-GlcNAc的添加是由N-乙酰葡萄糖胺轉移酶催化；而移除則是由 N-乙?；咸烟擒彰复呋コＳ捎贠-GlcNAc糖基化的絲氨酸/蘇氨酸殘基往往與蛋白激酶磷酸化修飾位點是重復或接近的，所以O-GlcNAc糖基化往往可以通過與蛋白激酶相互作用參與多種細胞途徑和功能調節(jié)[27]。如同磷酸化過程一樣，借著OGA/OGT的調控，O-GlcNAc糖基化與蛋白質磷酸化修飾相互作用，參與許多細胞調控過程。本研究還表明，O-GlcNAc糖基化參與調節(jié)自噬反應。因此，通過調控O-GlcNAc糖基化來調節(jié)NP細胞自噬以影響椎間盤退化性病變成為一個相當有潛力的研究焦點。