金 愛， 王宏鍵， 王旭東*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025)

乳腺癌是女性最常見的激素依賴性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1-2]。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一種由53個(gè)氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽,可與靶細(xì)胞上的EGF受體特異性識別，最終促進(jìn)靶細(xì)胞DNA合成及有絲分裂[3-4]。以往研究證明，EGF可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5-6]，EMT作為一種生物學(xué)過程，可使上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞[5-6]，還可使上皮來源的惡性腫瘤獲得遷移和侵襲能力[7-8]，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是增強(qiáng)乳腺癌轉(zhuǎn)移的必要條件[9]，提示有效抑制EMT可能是遏制乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本課題組前期工作顯示，EGF可通過Calpain誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移[10]，但Calpain是否參與EGF誘導(dǎo)的EMT還未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究主要對此進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、抗生素(penicillin and streptomycin，美國Hyclone 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，EGF(美國Peprotech)，Calpeptin(美國sigma公司)，抗FN多克隆抗體(美國abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP，羊抗小兔IgG-HRP購自美國Santa Cruz公司，抗E-cadherin多克隆抗體、抗GAPDH多克隆抗體(南京Bioworld公司)，蛋白濃度測試試劑盒(上海碧云天公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 Model 310恒溫CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇州凈化，MiniVE電泳設(shè)備購自美國GE公司，CKX41倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國SynGene公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS、1% 抗生素、89% RPMI-1640培養(yǎng)基中，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS、1% 抗生素、89% DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2及飽和濕度。

1.2.2藥物處理 取對數(shù)期細(xì)胞傳代于6孔板或12孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～90%時(shí)，更換成不含血清的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，當(dāng)細(xì)胞生長至所需實(shí)驗(yàn)密度時(shí)，加EGF(50 μg/L)處理或加入Calpeptin(10 μmol/L)預(yù)處理4 h后用EGF處理。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將生長狀態(tài)良好的模型細(xì)胞鋪于12孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至90%～100%密度后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，用200 μL槍頭在12孔板皿底作“十字”劃痕，以PBS清洗掉漂浮細(xì)胞。加EGF處理或加入Calpeptin預(yù)處理4 h后用EGF處理模型細(xì)胞。分別在0 h、24 h和48 h時(shí)在標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行拍照記錄，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞劃痕區(qū)域?qū)挾?，?jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=[(0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

1.2.4蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測模型細(xì)胞FN和E-cadherin表達(dá)變化 消化模型細(xì)胞并鋪于6孔板，次日更換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%，加EGF處理或加入Calpeptin預(yù)處理4 h后用EGF處理模型細(xì)胞，于處理結(jié)束后提取蛋白，配制含1 mmol/L蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液并于冰盒中裂解20 min，于4 ℃離心機(jī)中以12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至標(biāo)記好的EP管中，立即進(jìn)行蛋白定量。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(30 μg/泳道)，濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜。5%牛血清白蛋白室溫封閉1～2 h，TBST洗膜3次/10 min，然后按要求加入抗FN多克隆抗體(1∶1 000)、抗E-cadherin多克隆抗體 (1∶1 000)室溫孵育2 h。TBST洗膜3次/10 min，加入相應(yīng)二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，用凝膠成像儀進(jìn)行成像拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EGF促進(jìn)模型細(xì)胞遷移

EGF處理24 h和48 h時(shí)均能顯著促進(jìn)模型細(xì)胞遷移。與對照組比較，EGF組MCF-7細(xì)胞24 h時(shí)遷移率增加(149.2±10.1)%，48 h時(shí)遷移率增加(246.7±14.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對照組比較，EGF組MDA-MB-231細(xì)胞24 h時(shí)遷移增加(55.0±4.3)%，48 h時(shí)遷移率增加(90.9±8.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

(1)與對照組比較， P<0.01圖1 EGF不同誘導(dǎo)時(shí)間兩種乳腺癌模型細(xì)胞遷移Fig.1 Migration of two breast cancer models induced by EGF at different time

2.2 EGF誘導(dǎo)模型細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下調(diào)和FN表達(dá)上調(diào)

EGF處理24 h、48h和72 h時(shí)均能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞FN表達(dá)上調(diào)和E-cadherin(E-cad)表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中在48 h時(shí)EGF顯示具有最佳誘導(dǎo)效應(yīng)，見圖2。

2.3 Calpeptin抑制EGF誘導(dǎo)的模型細(xì)胞遷移

Calpeptin(10 μmol/L)預(yù)處理能顯著抑制EGF誘導(dǎo)的模型細(xì)胞遷移。與EGF組相比，EGF+Calpeptin組MCF-7細(xì)胞24 h時(shí)遷移降低(88.2±7.6)%，48 h時(shí)遷移率降低(68.3±5.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與EGF組比較，EGF+Calpeptin組MDA-MB-231細(xì)胞24 h時(shí)遷移率降低(29.1±2.5)%，48 h時(shí)遷移率增加(39.6±3.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

2.4 Calpeptin抑制EGF誘導(dǎo)的模型細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下調(diào)和FN表達(dá)上調(diào)

Calpeptin預(yù)處理EGF處理模型細(xì)胞48 h時(shí)，顯著抑制EGF誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞FN表達(dá)上調(diào)和E-cad表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

3 討論

眾所周知，乳腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移[11]。而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)生物學(xué)過程，包括原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落、遷移、侵襲、黏附及血管生成等[12]。已有大量研究報(bào)道乳腺癌細(xì)胞EMT伴隨遷移和侵襲活動(dòng)增強(qiáng)[13-14]。臨床研究顯示，EMT標(biāo)志物E-cadherin和波形蛋白與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性[15]。提示EMT是引起乳腺癌遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物學(xué)行為之一。本課題組前期工作顯示， EGF可促進(jìn)ER陽性的MCF-7細(xì)胞遷移[10]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGF不僅能誘導(dǎo)ER陽性的MCF-7細(xì)胞遷移，同時(shí)在ER陰性的MDA-MB-231細(xì)胞中也發(fā)揮類似誘導(dǎo)效應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGF能顯著誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞FN蛋白表達(dá)上調(diào)和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。而FN表達(dá)上調(diào)和E-cadherin的減少或丟失被認(rèn)為是EMT的重要標(biāo)志[16]。提示EGF可誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞EMT。本課題組前期工作報(bào)道，Calpain抑制劑預(yù)處理可抑制EGF誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移[10]。而本研究在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中也觀察到了相類似的現(xiàn)象。為觀察Calpain是否參與EGF誘導(dǎo)的模型細(xì)胞EMT，本研究進(jìn)一步觀察了Calpain特異性抑制劑Calpeptin的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示，Calpeptin可顯著抑制EGF誘導(dǎo)的FN蛋白表達(dá)上調(diào)和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。提示，抑制Calpain可抑制EGF誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞EMT。

(1)與0 h時(shí)比較， P<0.01圖2 EGF不同誘導(dǎo)時(shí)間對兩種乳腺癌細(xì)胞中FN和E-cad蛋白水平表達(dá)的影響Fig.2 Effects of EGF on the expression of FN and E-cad protein levels

(1)與EGF組比較，P<0.01圖3 Calpeptin抑制EGF不同誘導(dǎo)時(shí)間的乳腺癌細(xì)胞遷移Fig.3 Calpeptin inhibits the migration of breast cancer cells induced by EGF

(1)與EGF組比較， P<0.01圖4 Calpeptin預(yù)處理抑制EGF對兩種乳腺癌細(xì)胞E-cadherin和FN表達(dá)的誘導(dǎo)Fig.4 Calpeptin pretreatment inhibits EGF-induced expression of E-cadherin and FN in model cells

綜上所述，EGF能誘導(dǎo)ER陽性乳腺癌MCF-7和ER陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞EMT和遷移，而本研究首次發(fā)現(xiàn)上述效應(yīng)可能與Calpain的介導(dǎo)作用相關(guān)。大量證據(jù)表明Calpain與包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，如參與腫瘤轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖[17-18]。因此，干預(yù)Calpain可能有助于遏制EGF的促癌作用。Calpain包括多種亞型分子，廣泛表達(dá)的Calpain分為μ-鈣蛋白酶(Calpain1)和m-鈣蛋白酶(Calpain2)[19]。本研究下一步實(shí)驗(yàn)將會重點(diǎn)探討Calpain1和Calpain2在上述生物學(xué)行為中的作用，為臨床乳腺癌治療提供理論依據(jù)。