江錫銘 黃龍 黃臻輝

摘 要 采用Fmoc固相合成法合成血管緊張素Ⅱ，通過采用高替代度Fmoc-Phe-Wang樹脂作為固相載體、FmocArg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA與Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶聯(lián)體系、三氟乙酸/三異丙基硅烷/水裂解體系等措施，提高了合成工藝的經(jīng)濟(jì)性、安全性、易操作性和生產(chǎn)效率，且所得產(chǎn)品粗品的純度高達(dá)93.5%。

關(guān)鍵詞 血管緊張素Ⅱ 固相合成 高替代度樹脂

中圖分類號(hào)：O629.72； TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）07-0069-02

Process study on solid-phase synthesis of angiotensinⅡ

JIANG Ximing， HUANG Long， HUANG Zhenhui*

（SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Solid-phase synthesis of angiotensinⅡwas performed by taking high degree of substitution Fmoc-PheWang resin as a solid carrier， both Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA and Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC as coupling system， trifluoroacetic acid/triisopropylsilane/water as hydrolysis system and other measures so as to improve the efficiency， safety and operability of the synthesis process and the production efficiency， and the purity of angiotensinⅡcrude product could reach to as high as 93.5%.

KEY WORDS angiotensinⅡ； solid-phase synthesis； resin of high substitution

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ， AngⅡ）是八肽類物質(zhì)，氨基酸序列為Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe，臨床上用作急救用升壓藥物。AngⅡ能特異性地升高血壓和增加周圍血管阻力，通過支配血管平滑肌感受器而致血管收縮，升壓效能較一般的擬交感神經(jīng)胺類藥物（如去甲腎上腺素、新福林、間羥胺、恢壓敏等）強(qiáng)，且無組織壞死、影響腎功能之嚴(yán)重副作用[1]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，建立了AngⅡ的新固相合成工藝。

1 材料和試劑

Wang樹脂（替代度1.23 mmol/g），天津南開和成科技有限公司生產(chǎn)；保護(hù)氨基酸（Fmoc-AA-OH）、二異丙基碳二亞胺（DIC）、苯并三氮唑-N， N， N′， N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1-羥基苯并三氮唑（HOBt）、二異丙基乙胺（DIPEA）、三異丙基硅烷（TIS）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），均吉爾生化（上海）有限公司生產(chǎn)；三氟乙酸、色譜乙腈，均美國Tedia有限公司生產(chǎn)；哌啶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；N， N′-二甲基甲酰胺（DMF）、吡啶、醋酐、二氯甲烷、甲醇，均上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

2 AngⅡ的固相合成

在HOBt/DIC/DMAP的催化作用下，F(xiàn)moc-Phe-OH的羧基端與固相載體Wang樹脂的羥基端共價(jià)結(jié)合[6]，形成Fmoc-Phe-Wang樹脂。其后，以該樹脂上氨基酸的氨基作為反應(yīng)活性位點(diǎn)，逐一偶聯(lián)脯氨酸、組氨酸、纈氨酸、酪氨酸、纈氨酸、精氨酸、天冬酰胺，得到多肽樹脂。將多肽鏈從多肽樹脂上切割下來，脫除氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基，即得AngⅡ粗品。

2.1 Fmoc-Phe-Wang樹脂制備

稱取Wang樹脂50 g（100 ～ 200目），置于多肽合成儀中，用500 ml DMF洗滌、抽干，再用500 ml二氯甲烷溶脹、抽干。加入Fmoc-Phe-OH 71.5 g、HOBt 24.9 g、DIC 28.9 ml、DMF 300 ml、二氯甲烷100 ml，利用氮?dú)饬鲗⒎磻?yīng)系統(tǒng)迅速降溫至16 ℃，然后緩慢加入DMAP1.5 g，26 ℃下攪拌18 h。抽干，用DMF洗滌、抽干。加入吡啶49 ml、醋酐58 ml、二氯甲烷500 ml，27 ℃下攪拌3 h。抽干。用DMF、甲醇交叉洗滌，抽干，真空干燥至恒重，得Fmoc-Phe-Wang樹脂75 g（60 mmol），測(cè)得其替代度為0.80 mmol/g。

2.2 Fmoc-Pro-Phe-Wang樹脂制備

在用500 ml DMF溶脹2次、抽干后的Fmoc-PheWang樹脂中，加入含20%哌啶的DMF溶液500 ml，25 ℃下攪拌脫Fmoc保護(hù)2次（第1次10 min，第2次20 min），然后依次用DMF洗滌1次、甲醇洗滌2次、DMF洗滌1次、二氯甲烷洗滌1次，抽干。加入FmocPro-OH 40.5 g、HOBt 16.2 g、HBTU 45.5 g、DMF 350 ml、二氯甲烷100 ml，利用氮?dú)饬鲗⒎磻?yīng)系統(tǒng)迅速降溫至15 ℃，再滴加DIPEA 31.4 ml，25 ℃下攪拌2.5 h，茚三酮檢測(cè)呈陰性后抽干，用甲醇洗滌1次、DMF洗滌2次，抽干，得Fmoc-Pro-Phe-Wang樹脂。

2.3 Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-ProPhe-Wang樹脂制備

參照Fmoc-Pro-Phe-Wang樹脂制備步驟，先后進(jìn)行在含20%哌啶的DMF溶液中的脫Fmoc保護(hù)，DMF、甲醇、DMF、二氯甲烷交叉洗滌，與Fmoc-AA-OH偶聯(lián)等操作，其中偶聯(lián)體系依次為：①Fmoc-His（Trt）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA；②Fmoc-Val-OH/HBTU/HOBt/DIPEA；③Fmoc-Tyr（tBu）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA；④Fmoc-Val-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA；⑤Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/ DIPEA和Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用；⑥Boc-AsnOH/HOBt/DIC。偶聯(lián)條件為（25±3）℃下攪拌2 ～ 3 h，茚三酮檢測(cè)呈陰性為反應(yīng)終點(diǎn)。與Boc-Asn-OH偶聯(lián)完成后，依次用甲醇、DMF、甲醇交叉洗滌，抽干至恒重，得Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-PheWang樹脂157.4 g。

2.4 AngⅡ制備

按三氟乙酸∶TIS∶水=95∶2.5∶2.5（V/V/V）配制裂解液1.6 L，攪拌下加入Boc-Asn-Arg（Pbf）-ValTyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-Phe-Wang樹脂157.4 g，26 ℃下攪拌2.5 h。過濾，濾液通過減壓蒸餾濃縮，然后加入冷甲基叔丁基醚沉淀，經(jīng)離心處理、洗滌、抽干，得AngⅡ粗品70.5 g。

3 討論

3.1 Fmoc-Phe-Wang樹脂替代度的選擇

高載量樹脂適用于規(guī)?；a(chǎn)，能節(jié)減物料成本、提高生產(chǎn)效率。在本研究中，我們?cè)褂貌煌娲鹊腇moc-Phe-Wang樹脂來合成AngⅡ?？紤]到AngⅡ是由8個(gè)氨基酸組成的多肽，所以最初選擇的Fmoc-PheWang樹脂替代度為0.50 mmol/g。此外，考慮到AngⅡ固相合成中須使用Fmoc-Arg（Pbf）-OH，其側(cè)鏈保護(hù)基2， 2， 4， 6， 7-五甲二氫苯并呋喃-5-磺?；≒bf）的空間位阻過大，影響偶聯(lián)效率，故采取了加大Fmoc-Arg（Pbf）-OH用量、延長(zhǎng)偶聯(lián)時(shí)間等措施。實(shí)驗(yàn)中選擇的FmocPhe-Wang樹脂替代度最大達(dá)0.86 mmol/g，最后所得AngⅡ粗品的品質(zhì)良好。

3.2 偶聯(lián)體系的選擇

偶聯(lián)體系的選擇在多肽固相合成中非常關(guān)鍵，適宜的偶聯(lián)體系可大大提高多肽產(chǎn)品的純度和收率。例如，本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/ HOBt/DIPEA偶聯(lián)體系所得多肽產(chǎn)品的純度為86.79%，主要雜質(zhì)含量為6.62%，而采用Fmoc-Arg（Pbf）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA和Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶聯(lián)體系所得多肽產(chǎn)品的純度為93.53%，主要雜質(zhì)含量為1.74%，品質(zhì)明顯更優(yōu)。

3.3 裂解條件的選擇

本研究對(duì)Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-Phe-Wang樹脂的裂解條件進(jìn)行了多方面的研究，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明：采用三氟乙酸/TIS/水和三氟乙酸/TIS/乙二硫醇/水裂解體系所得AngⅡ粗品的品質(zhì)無明顯差異；低溫4 ～ 10 ℃下裂解16 ～ 20 h和常溫（25±3）℃下裂解2 ～ 3 h所得AngⅡ粗品的品質(zhì)無明顯差異。常溫裂解工藝更為簡(jiǎn)便，更為環(huán)保，更適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。

4 小結(jié)

我們采用Fmoc固相合成法合成AngⅡ，并在具體合成過程中通過采用高載量樹脂、Fmoc-Arg（Pbf）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA與Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶聯(lián)體系、摒棄了有惡臭味的乙二硫醇的裂解體系等措施，提高了合成工藝的經(jīng)濟(jì)性、安全性、易操作性和生產(chǎn)效率，且所得AngⅡ粗品的純度高達(dá)93.5%。對(duì)AngⅡ粗品再進(jìn)行成鹽反應(yīng)和后處理等操作，即可得純度為99.5%的白色AngⅡ醋酸鹽純品。

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