張磊，劉春亮，王龍娟，錢丹華

作者單位：滁州市食品藥品檢驗(yàn)中心化學(xué)室，安徽 滁州 239000

氨糖美辛腸溶片是由鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛兩種組分按3∶1比例的復(fù)方制成的，是一種消炎鎮(zhèn)痛藥。研究顯示，在非甾體抗炎藥（NSAIDs）制劑中加入適當(dāng)比例的氨基葡萄糖可以有效增強(qiáng)前者的鎮(zhèn)痛作用［1］，減少前者的用量，從而減少前者對(duì)病人造成的不適，如胃損傷［2-3］和肝損傷［4］等。氨糖美辛腸溶片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（二部）第六冊(cè)，其中鹽酸氨基葡萄糖含量測(cè)定采用Elson-Morgan比色法［5］，操作過程易受干擾。吲哚美辛的含量測(cè)定采用提取后滴定法，專屬性與重現(xiàn)性差。近年也有采用HPLC法測(cè)定氨糖美辛腸溶制劑中鹽酸氨基葡萄糖［6-7］和吲哚美辛［8-9］含量的報(bào)道，然而能夠同時(shí)高效準(zhǔn)確測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量的報(bào)道很少。本研究參考美國(guó)藥典最新版本（40版），采用NH2色譜柱，在雙波長(zhǎng)條件下，同時(shí)測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛的含量。本方法操作簡(jiǎn)便，耐用性良好，能夠排除系統(tǒng)干擾，靈敏度和重復(fù)性均優(yōu)于部頒標(biāo)準(zhǔn)，可用于氨糖美辛腸溶片中雙組分的質(zhì)量控制。

本研究起止時(shí)間為2017年9月至2018年2月。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-M20A PDA檢測(cè)器（日本島津公司）；Hypersil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；XPE105電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.2 試藥鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)140649-200702）；吲哚美辛對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100258-200904）；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨糖美辛腸溶片（A公司，批號(hào)171003；B公司，批號(hào)20161201；C公司，批號(hào)20161201）。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Hypersil NH2（5 μm，4.6 mm×250mm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（取3.5g磷酸氫二鉀和0.25 mL氫氧化銨，加水至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5）（70∶30）；流速：1.0mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm和254nm雙波長(zhǎng)測(cè)定。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品49.05 mg置25 mL量瓶中，加溶劑［乙腈-水（50∶50）］20 mL振搖使溶解并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液①；精密稱取吲哚美辛對(duì)照品16.43 mg置于25 mL量瓶中，加溶劑20 mL振搖使溶解并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液②。精密量取貯備液①5 mL置于10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取貯備液②5 mL置于10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為吲哚美辛對(duì)照品溶液。精密量取貯備液①和貯備液②各5 mL混勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖100 mg的細(xì)粉，置100 mL量瓶中，加溶劑適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備參照氨糖美辛腸溶片的處方組成，稱取除鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛外的其它輔料成分，按供試品溶液的制備方法制備。2.5 專屬性試驗(yàn)將以上三種溶液，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示，該條件適用于同時(shí)測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛的含量，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察精密量取“2.2”項(xiàng)配置的貯備液①和貯備液②，分別用溶劑稀釋，得到系列濃度為98.10、196.20、392.40、784.80、1 471.50、1 962.00 mg/L的鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液和32.86、65.72、131.44、262.88、492.90、657.20 mg/L的吲哚美辛對(duì)照品溶液，按照“2.1”色譜條件進(jìn)樣，在195 nm波長(zhǎng)處記錄氨基葡萄糖色譜圖，在254nm波長(zhǎng)處記錄吲哚美辛色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，分別得到線性回歸方程。鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝601.38X+1 304.05，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 9，線性范圍為98.10～1 962.00 mg/L；吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝27 995.61X-274 829.70，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 8，線性范圍為32.86～657.20 mg/L。

圖1 雙波長(zhǎng)法測(cè)定氨糖美辛腸溶片含量的色譜圖：A為鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品（195 nm）；B為吲哚美辛對(duì)照品（254 nm）；C為混合對(duì)照品（195 nm）；D為混合對(duì)照品（254 nm）；E為樣品（195 nm）；F為樣品（254 nm）；G為陰性對(duì)照溶液（195 nm）；H為陰性對(duì)照溶液（254 nm）

2.7 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果氨基葡萄糖峰面積的RSD為0.64%；吲哚美辛峰面積的RSD為0.06%。表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)（171003）樣品，按“2.3”方法制備6份，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，結(jié)果鹽酸氨基葡萄糖含量分別為標(biāo)示量的103.94%、103.88%、104.03%、102.92%、104.21%、103.92%，平均值為103.81%，RSD＝0.44%（n＝6）；吲哚美辛含量分別為標(biāo)示量的99.88%、98.68%、100.36%、100.00%、100.18%、99.86%，平均值為100.32%，RSD＝0.60%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h各進(jìn)樣一次，記錄峰面積，結(jié)果氨基葡萄糖和吲哚美辛峰面積的RSD分別為0.59%和0.52%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn)按供試品溶液制備方法制備樣品溶液（含鹽酸氨基葡萄糖2 562.4 mg/L，吲哚美辛816.1 mg/L），精密量取2 mL，共18份，分別置10 mL量瓶中，精密加入“2.2”鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液和吲哚美辛對(duì)照品溶液3、5、7 mL各3份，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按“2.1”色譜條件測(cè)定。計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率（n＝9）分別為99.15%和99.28%，RSD分別為0.97%和0.66%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)（n＝9）

2.11 定量限取“2.2”項(xiàng)配置貯備液①，用溶劑稀釋30倍，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，信噪比為10，溶液濃度為65.40 mg/L，確定為鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品的定量限。取“2.2”項(xiàng)配置貯備液②，用溶劑稀釋20 000倍，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，信噪比為10，溶液濃度為0.033 mg/L，確定為吲哚美辛對(duì)照品的定量限。

2.12 含量測(cè)定取三批樣品分別依“2.3”方法制備，依“2.1”色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算含量，并與現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 氨糖美辛腸溶片含量測(cè)定結(jié)果（標(biāo)示量的百分含量）/%

2.13 含量均勻度測(cè)定取樣品10片，分別置100 mL量瓶中，加適量溶劑振搖使溶解，用溶劑定容至刻度。依前述方法測(cè)定每片中吲哚美辛的含量，計(jì)算A+2.2s值。結(jié)果三批吲哚美辛的A+2.2s值分別為6.0、11.8和18.5。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇在測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖的方法中，美國(guó)藥典（32版）采用C8色譜柱［10］，美國(guó)藥典最新版（40版）采用NH2色譜柱［11］，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［12］采用C18色譜柱。在測(cè)定吲哚美辛的方法中，美國(guó)藥典最新版（40版）采用C18色譜柱，中國(guó)藥典2015年版二部采用C18色譜柱。按照上述條件進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用C8色譜柱和C18色譜柱時(shí)，氨基葡萄糖峰的出峰時(shí)間都相對(duì)較早，其中C18色譜柱，與氯離子峰幾乎完全重合，也不能與吲哚美辛峰完全分離，改變流動(dòng)相的比例，氨基葡萄糖峰的保留時(shí)間幾乎沒有變化。考慮氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，使用NH2色譜柱一般能得到較好的分離，同時(shí)參考其他糖類物質(zhì)的含量測(cè)定方法［13-14］，最后決定采用NH2色譜柱進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果表明NH2色譜柱較為適合于氨糖美辛腸溶片的含量測(cè)定。

3.2 波長(zhǎng)的選擇由于氨基葡萄糖在紫外區(qū)吸收非常弱，甚至無吸收，見圖2。目前，美國(guó)藥典（40版）采用195 nm波長(zhǎng)測(cè)定。中國(guó)藥典2015年版二部采用228 nm測(cè)定吲哚美辛的含量，在很多研究中，254 nm也被廣泛應(yīng)用于測(cè)定吲哚美辛的含量［15-16］。按照上述條件進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用195 nm能較好地實(shí)現(xiàn)氨基葡萄糖峰的分離。在195 nm條件下，吲哚美辛峰易受氯離子峰干擾，故不宜采用195 nm同時(shí)測(cè)定雙組分的含量。在228 nm條件下，吲哚美辛峰也易被氯離子峰輕微干擾。結(jié)合吲哚美辛峰光譜圖，見圖3，本實(shí)驗(yàn)選用254 nm。在此條件下，氯離子幾乎無吸收，不會(huì)對(duì)吲哚美辛峰造成干擾。因此，本研究最終采用195 nm作為氨基葡萄糖檢測(cè)波長(zhǎng)，254 nm作為吲哚美辛檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 氨基葡萄糖峰光譜圖

圖3 吲哚美辛峰光譜圖

3.3 流動(dòng)相的選擇本研究的重點(diǎn)考慮因素是氯離子峰和氨基葡萄糖峰的有效分離。美國(guó)藥典（32版）以磷酸鹽緩沖液（0.05%磷酸，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（40∶60）為流動(dòng)相。在實(shí)際試驗(yàn)中，由于該流動(dòng)相水相比例較高，影響NH2色譜柱的使用壽命，重復(fù)進(jìn)樣后，理論板數(shù)迅速下降，拖尾因子迅速上升。因本研究采用NH2色譜柱，為延長(zhǎng)色譜柱壽命，提高耐用性，在流動(dòng)相中適當(dāng)提高乙腈比例，在親水作用色譜模式下，使用較高比例的乙腈來保留親水化合物，并加入磷酸氫二鉀以改善峰型，通過氫氧化銨調(diào)節(jié)pH值使氨基葡萄糖呈弱陰離子化合物，最終確定流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（取3.5 g磷酸氫二鉀和0.25 mL氫氧化銨，加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5）（70∶30）。采用該流動(dòng)相，在195 nm條件下，氨基葡萄糖保留時(shí)間約為11.0 min，氯離子保留時(shí)間約為3.2 min，實(shí)現(xiàn)了氯離子與氨基葡萄糖的有效分離。在254 nm條件下，吲哚美辛保留時(shí)間約為2.6 min。該系統(tǒng)下，氨基葡萄糖與吲哚美辛理論板數(shù)保持穩(wěn)定，峰形良好。結(jié)果顯示，本次試驗(yàn)選定的氨糖美辛腸溶片含量測(cè)定方法耐用性良好。

3.4 含量均勻度的控制中國(guó)藥典2015年版四部規(guī)定，單劑標(biāo)示量小于25 mg或主藥含量小于每個(gè)單劑體質(zhì)量25%的片劑應(yīng)檢查含量均勻度。氨糖美辛腸溶片每片含吲哚美辛25 mg，且小于每個(gè)單劑體質(zhì)量的25%，應(yīng)控制其含量均勻度。本研究考察了3個(gè)企業(yè)各1批氨糖美辛腸溶片的吲哚美辛含量均勻度。其中1個(gè)企業(yè)的一批樣品含量均勻度A+2.2s值大于15.0。由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定氨糖美辛腸溶片的含量均勻度要求，生產(chǎn)企業(yè)在混料的過程中的可能會(huì)存在一定問題。因此在標(biāo)準(zhǔn)中增加含量均勻度檢查項(xiàng)，對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量控制，全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣是有必要的。3.5 小結(jié)本實(shí)驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)HPLC檢測(cè)法，建立了同時(shí)測(cè)定氨糖美辛腸溶片中鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量及含量均勻度的方法。與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，具有專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)勢(shì)，且本方法穩(wěn)定性高、線性范圍寬、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為氨糖美辛腸溶片質(zhì)量控制的方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了有價(jià)值的參考。