庫爾班江·阿布力克木 許盛飛 曾瑾 袁曉奕

膀胱過度活動癥(overactive bladder， OAB)是臨床常見的排尿功能障礙性疾病，對患者的工作和生活均造成嚴重影響，隨著年齡的增長其發(fā)病率逐漸提高[1]。對于OAB的治療目前尚無法取得滿意效果[2]。嘌呤受體P2X3是一種ATP門控的離子通道蛋白，近年來研究證實P2X3在膀胱充盈感覺和痛覺的產生和易化過程中發(fā)揮核心作用[3-4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)女性原發(fā)性OAB患者其膀胱敏感性與膀胱內P2X3表達水平具有顯著相關性[5]，另有研究顯示OAB患者膀胱內某些可能與P2X3相關的microRNAs(miRNAs)出現(xiàn)異常表達[6]，因此推測靶向P2X3的miRNAs表達異常是致敏膀胱導致OAB的重要致病原因。本研究對靶向P2X3的miRNAs進行了系統(tǒng)篩選和鑒定，旨在尋找新的診斷OAB的分子標志物和潛在治療靶點。

材料與方法

一、實驗材料

人胚腎293TN細胞系，DMEM 培養(yǎng)液，10%胎牛血清，感受態(tài)大腸桿菌 TOP10，熒光素酶檢測試劑盒，質粒提取試劑盒，P2X3 一抗。

二、實驗方法

1.利用在線miRNA數(shù)據(jù)庫/預測軟件TargetScan、miRDB、miRanda、PicTar、RNA22、miRWalk、PITA在線查詢P2X3 3′端非編碼區(qū)(3′untranslated region， 3′UTR)序列的靶向miRNA。

2.雙熒光素酶報告基因P2X3 3′UTR質粒的構建和提?。簭幕蛭膸熘秀^取P2X3序列全長，設計引物擴增P2X3 3′UTR全長，構建psiCHECK2-P2X3 3′UTR載體質粒。將構建的質粒分別轉化到大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細胞，擴增，提取質粒。

3.雙熒光素酶報告基因載體與 miRNA mimics/陰性對照(NC)共轉染 293TN細胞：將生物信息學方法預測的miRNA分別同psiCHECK2-P2X3 3′UTR雙熒光素酶報告基因質粒共轉染293TN細胞，并測定Firefly熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性，以Firefly 熒光素酶活性為內參，計算Renilla/Firefly比值(相對熒光素酶活性)。以轉染的miR-NC為1校正各比值，以此判斷預測的miRNA是否與P2X3 3′UTR序列結合。各轉染miRNA的熒光素酶結果同miR-NC比較。

4.將篩選得到的miRNAs mimics轉染293TN細胞，利用Western blot檢測P2X3轉錄后水平的變化，進一步篩選能夠靶向調控P2X3的miRNAs，選取Tubulin為內參。

5.突變體質粒的構建及鑒定：以已構建的 psiCHECK2-P2X3 3′UTR 質粒為基礎，按照其與不同 miRNA 結合的種子序列，設計點突變的 mutant位點，構建突變體載體質粒。按前述實驗步驟，將構建的突變體質粒分別轉化到大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細胞，擴增，提取質粒。再按前述實驗步驟，將突變體載體質粒與相應的miRNA mimics/NC共轉染293TN細胞，轉染細胞培養(yǎng) 48 h后，檢測熒光素酶活性，以最終確定特異性靶向結合P2X3 3′UTR的miRNAs。

三、統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，應用 SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，樣本均值間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、生物信息學軟件對靶向結合P2X3的miRNAs的預測分析

分析結果表明有多達21種miRNA可能與P2X3結合。見圖1。

二、熒光素酶報告系統(tǒng)驗證及轉染293TN細胞后P2X3的表達

驗證結果表明，有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能顯著下調報告基因的表達。在293TN細胞中過表達上述3種miRNAs后，P2X3蛋白表達顯著下調，證實這3種miRNAs可能靶向調控P2X3。見圖2。

圖2 過表達3種miRNAs后293TN細胞中P2X3蛋白的表達

三、特異性靶向結合P2X3 3′UTR的miRNAs的進一步驗證

構建相應的P2X3 3′UTR突變體的雙熒光素酶報告載體，再次進行熒光素酶檢測，最終確定特異性靶向結合P2X3 3′UTR的miRNAs共3種，為hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291。

討 論

嘌呤受體P2X是一組ATP門控的跨膜離子通道，由3個同源或異源的P2X亞基聚合而成。迄今發(fā)現(xiàn)的7個P2X(P2X1～7)亞基同源性約35%～50%，由大約400～600個氨基酸殘基組成，其C末端和N末端均位于細胞內，其余部分組成糖基化的胞外域，構成蛋白質的功能區(qū)。P2X3受體是由同源聚合體(P2X3)或異源聚合體(P2X2/3)組成的寡聚體，在正常生理條件下特異性地表達于外周感覺神經元、中間神經元和體內空腔臟器的上皮組織。研究顯示敲除P2X3基因的大鼠對外周和膀胱刺激導致的痛覺反應及排尿反射明顯減弱，表明P2X3在外周痛覺反射和膀胱容量反射的傳入通路中扮演著極其重要的角色[7]。OAB動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，膀胱內H+和表皮生長因子等細胞因子濃度的升高可增強P2X3途徑的信號傳遞，導致感覺神經纖維激活，誘發(fā)膀胱逼尿肌過度活動；P2X3受體又可以信號內吞體的形式逆向轉運至胞體，調節(jié)胞體中轉錄因子環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白的磷酸化水平，進一步提升神經纖維的興奮性，同時致敏的神經纖維還可通過上調脊髓內突觸前P2X3受體的表達水平來進一步放大上行性的傷害感受從而加重OAB癥狀[8]。由此可見，P2X3在膀胱充盈感覺和痛覺的產生、易化過程中發(fā)揮著核心作用。我們之前的研究同樣發(fā)現(xiàn)膀胱敏感性升高是女性原發(fā)性OAB發(fā)病的重要致病因素，且與膀胱黏膜內P2X3的表達水平具有統(tǒng)計學相關性[5]，提示P2X3過表達引起的膀胱過敏可能是導致原發(fā)性OAB發(fā)生的重要致病原因。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可靶向調控P2X分子，如miR-150在肺泡細胞內靶向調控P2X7，miR-186和miR-150在上皮性腫瘤(包括宮頸癌、子宮內膜癌、膀胱癌、乳腺癌)中靶向調控P2X7[9-10]。P2X3能否被miRNA調控，目前還沒有任何相關報道。有報道顯示Dicer酶缺乏的轉基因大鼠的膀胱被誘導致敏后，膀胱內P2X1和P2X3表達顯著升高，同時有若干相關miRNAs表達異常[6]，提示miRNA極有可能對P2X3具有靶向調控作用。

目前系統(tǒng)研究靶向單個基因miRNAs的方法的相關報道不多，根據(jù)其核心實驗方法的不同大致可分為兩類：一種稱為蛋白裂解芯片技術(lysate microarray， LMA)，主要是基于過表達miRNAs后目標蛋白水平的變化；另一種研究主要基于miRNA特異結合的靶基因3′UTR熒光素酶報告系統(tǒng)。以上兩種方法各有優(yōu)缺點，基于LMA的方法對生物信息學分析依賴程度較低，由于不同的生物信息學分析軟件基于的算法和數(shù)據(jù)庫差異較大，可能對最終的篩選結果造成影響，因此LMA的準確率更高，但是該方法對儀器和操作以及實驗成本要求較高，對于普通實驗室來說，難以開展；后者雖然對實驗條件的要求不高，但是受生物信息學分析的影響較大，且穩(wěn)定表達細胞系的篩選較為耗時，整個實驗周期較長。我們在后者的基礎上進行了改進和優(yōu)化，首先將多種生物信息學預測軟件的結果進行合并，盡量排除利用單一或少數(shù)軟件分析所造成的誤差和遺漏；其次用雙熒光素酶報告系統(tǒng)替代單熒光素酶報告系統(tǒng)，利用內置的Firefly熒光素酶作為內參，消除了轉染效率可能造成的差異，從而不需要構建穩(wěn)定表達細胞系，使得實驗周期大大縮短。我們利用該系統(tǒng)成功對泌尿系腫瘤中靶向OCT4基因的miRNAs進行了系統(tǒng)分析[11-12]。

本實驗通過采用TargetScan等生物信息學軟件，初步對人P2X3 3′UTR進行了綜合分析，結果發(fā)現(xiàn)分別有21種潛在的miRNAs可能與人P2X3靶向結合，在此基礎上我們構建了包含P2X3 3′UTR全長的雙熒光素酶報告系統(tǒng)psiCHECK2-P2X3，將該載體質粒分別與上述21種miRNAs共轉染293TN細胞，然后通過檢測報告基因的表達及轉錄后水平的變化進行篩選，初步證實共有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能夠靶向結合P2X3的3′UTR，并顯著下調其表達，表明確實有miRNA參與了對P2X3的靶向調控。

由于目前無法獲得可用的正常膀胱尿路上皮細胞系，而基于293TN細胞系的miRNA研究比較成熟，故本實驗中選取了293TN細胞系作為研究對象而非膀胱尿路上皮細胞系，我們希望通過本研究對miRNA治療OAB的可能性進行一些探索。而經293TN細胞系篩選出來的靶向調控P2X3的miRNAs能否在OAB的治療中起作用，需要進一步通過動物實驗進行驗證。未來，我們將在OAB患者相關組織標本中對分析得到的miRNAs進行表達檢測和統(tǒng)計學分析，并將篩選得到的P2X3相關miRNAs載體轉染OAB大鼠模型，以驗證靶向調控P2X3的miRNAs對OAB動物模型進行治療的可行性和有效性。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)共有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)參與了對P2X3的靶向調控，為OAB的臨床診斷和靶向治療提供了新的策略和作用靶點。