房晨陽，周霞，楊艷珍，梁李娟，龐敏*，王文桃，孫佳，劉宏延，王海龍

(山西醫(yī)科大學(xué)： 1. 第一醫(yī)院呼吸科； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 太原 030001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，病理變化表現(xiàn)為由慢性炎癥引起的呼吸道損傷，破壞肺部結(jié)構(gòu)，引起氣道重塑[1]。臨床主要應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑、激素抗炎劑、抗氧化劑等進(jìn)行對癥治療，難以改善肺功能，遠(yuǎn)期療效較差?？死?xì)胞蛋白16(club cell protein 16，CC16)主要由位于氣道上皮的club細(xì)胞分泌合成，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氣道CC16蛋白質(zhì)含量的減少，是引起慢性阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[3]，而給予CC16蛋白質(zhì)被視為干預(yù)肺部炎癥性疾病的一種措施[4]。本文在前期獲得重組大鼠CC16蛋白質(zhì)(rCC16)且確定其安全劑量的基礎(chǔ)上[5-6]，研究CC16對香煙煙霧(cigarette smoke，CS)聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制備的COPD小鼠肺組織病理改變及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue Inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

清潔級C57BL/6 小鼠40 只，8 周齡，體重為18 ～ 20 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供【SCXK(晉)2010-0002】，符合國家及國際動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心屏障環(huán)境中【SYXK(晉)2015-0001】，并按實(shí)驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷，且所有實(shí)驗操作均符合實(shí)驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：IACUC2014-16)。

1.1.2 試劑與儀器

芙蓉牌過濾嘴香煙(焦油量 12 mg；煙堿量 1.0 mg，煙氣CO量 14 mg)；TRIzol、RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq Kit(大連寶生物科技有限公司，中國)； BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific公司，美國)，兔抗小鼠MMP-9多克隆抗體、兔抗小鼠TIMP-1多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，中國)，其余試劑為國產(chǎn)分析純。自制熏煙箱(有機(jī)玻璃，長寬高分別為80 cm × 80 cm × 80 cm)； BX 41TF 型光學(xué)顯微鏡(日本電子株式會社)；PikoREAL實(shí)時定量熒光PCR儀(Thermo Scientific公司，美國)；UV-2602型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司，中國)；QWin圖象分析軟件(Leica公司，德國)，Tanon 2500 天能凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 重組大鼠CC16蛋白質(zhì)的制備

參照文獻(xiàn)[5]和[6]的方法制備并純化重組大鼠CC16蛋白質(zhì)(rCC16)。蛋白質(zhì)定量后溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成2 μg/μL于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗分組及COPD 模型建立

將40 只小鼠隨機(jī)均分為空白組、COPD 模型組、rCC16 劑量組1(1 μg/g體重)和rCC16劑量組2(2.5 μg/g體重)。除空白組不進(jìn)行COPD 模型制備外，其余小鼠均采用香煙煙霧吸入法制作COPD 穩(wěn)定期小鼠模型。將除空白組外的各組小鼠(共30只)分別置于熏煙箱中進(jìn)行人為被動吸煙，每日吸入煙霧2次(上午1次、下午1次)，每次使用12支，時間大致為60 min，每個星期6 d，整個熏煙持續(xù)12 周。在熏煙期間，持續(xù)監(jiān)測熏煙箱內(nèi)O2含量，保證其始終在19.2% ～ 20.5% 范圍之內(nèi)(如氧濃度低于標(biāo)準(zhǔn)，停止香煙燃燒，僅泵入空氣)。rCC16 干預(yù)組大鼠于吸煙第3月開始，應(yīng)用不同劑量 rCC16 對吸煙小鼠進(jìn)行滴鼻干預(yù)。rCC16 劑量組1(1 μg/g體重)和rCC16劑量組2(2.5 μg/g體重)，每次20 μL，每日1次?？瞻捉M和COPD組則用等量的PBS來替代，持續(xù)干預(yù)4周。滴鼻操作由固定人員完成，操作前先撫摸小鼠，增進(jìn)熟悉，減少小鼠緊張；將20 μL滴鼻液吸入吉爾森 P20微量移液器(2 ～ 20 μL)，左手固定小鼠，右手持移液器進(jìn)行滴鼻。為減輕小鼠的不適感，滴鼻在兩個鼻孔間隔進(jìn)行，1 只小鼠的滴鼻操作在3 min完成。

1.2.3 一般行為觀察

觀察各小鼠精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化及大小便情況等。

1.2.4 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg體重)進(jìn)行麻醉，腹主動脈取血后，打開胸腔，暴露雙肺，將右肺部取下，放入 4%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片(4 μm 厚)，行常規(guī)H&E染色，顯微鏡下分析各組小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 Real-time PCR檢測小鼠肺組織MMP-9，TIMP-1 mRNA的表達(dá)

小鼠麻醉后，將左肺取出，迅速置于液氮中進(jìn)行研磨，加入 1 mL Trizol裂解液，按說明書提取各組組織總RNA，紫外分光光度計測量濃度后取1 μg按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。qPCR的引物及擴(kuò)增條件參照已發(fā)文章[7]，具體為94℃ 5 min，接著94℃ 30 s、58℃ 30 s，70℃ 45 s，40個循環(huán)，將目的基因的Ct用大鼠GAPDH的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化用比較閾值法(即2-△△CT)表示。此外，PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測。小鼠MMP-9的上游引物序列為5’- CGTCGTGATCCCCACTTACT -3’，下游引物序列為5’- AACACACAGGGTTTGCCTTC -3’；TIMP-1的上游引物序列為5’- CATGGAAAGCCTCTGTGGAT -3’，下游引物序列為5’- CTCAGAGTACGCC AGGGAAC -3’；β-actin(β-肌動蛋白)的上游引物序列為5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG -3’，下游引物序列為5’- ACCAGAGGCATACAGGGACA -3’，引物由北京(中美)泰和生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測小鼠肺組織MMP-9，TIMP-1 蛋白質(zhì)的表達(dá)

嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書操作，切片脫蠟至水，微波修復(fù)，洗滌，滴加山羊血清封閉，滴加一抗(MMP-9，1∶100; TIMP-1，1∶100) 4℃ 過夜孵育，第2天PBS洗滌，滴加二抗(1∶500)，PBS洗滌，DAB 顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，流水沖洗，脫水，樹膠封片。每只小鼠的組化切片選取3個視野，鏡下觀察(×200)。用Leica圖像分析系統(tǒng)對每組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析處理，胞質(zhì)中的棕色顆粒為陽性表達(dá)，表達(dá)水平用灰度值來表示，灰度值越高，表達(dá)強(qiáng)度越小。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般行為觀察

空白組小鼠活潑好動，皮毛柔順有光澤，飲食攝水正常，體重隨飼養(yǎng)周期增大。模型組小鼠皮毛枯槁無光澤，撮毛，行動遲緩，呼吸急促，進(jìn)食進(jìn)水量減少，體重較空白組明顯減輕, 差異有顯著性(n=10，P< 0.05)。rCC16干預(yù)組1和干預(yù)組2小鼠體型偏瘦，活動較自如，皮毛欠潤澤，氣促不明顯，體重較模型組增加，以干預(yù)組2增加明顯。與模型組比較，干預(yù)組2在干預(yù)后第3周開始體重明顯增加，而rCC16干預(yù)組1在第4周體重才開始增加，差異有顯著性(n=10，P< 0.05)(圖1)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與COPD組比較，#P<0.05，▲P<0.05。(下圖同)圖1 各組小鼠在rCC16處理前后體重變化Note.* P< 0.05, vs control group;# P< 0.05,▲ P< 0.05, vs COPD group.(The same in the following figures)Figure 1 Body weight of the mice in different groups before or after rCC16 treatment

2.2 rCC16干預(yù)可以減輕COPD小鼠的肺部損傷

病理學(xué)觀察結(jié)果顯示空白組小鼠肺組織正常，呼吸道及肺泡結(jié)構(gòu)正常，無代償性肺氣腫形成，肺泡腔未見炎癥細(xì)胞(圖2A)。COPD模型組小鼠肺泡的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的破壞，肺泡間隔增寬，部分肺泡壁斷裂融合形成肺泡氣腫，代償性肺氣腫形成，血管及支氣管炎癥細(xì)胞浸潤(圖2B)。1 μg/g體重 rCC16干預(yù)后，小鼠仍然有肺大泡的形成，但較之COPD組明顯減少，且炎性細(xì)胞浸潤也有所改善(圖2C)。2.5 μg/g體重 rCC16干預(yù)后炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺大泡的形成也明顯減少，肺泡結(jié)構(gòu)趨于完整(圖2D)。

2.3 rCC16干預(yù)減少COPD小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組小鼠比較，COPD組小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)量顯著增加，表達(dá)差異有顯著性(n=10，P< 0.01)，rCC16干預(yù)組1可以降低MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)，表達(dá)差異有顯著性(n=10，P< 0.05)，而rCC16干預(yù)組2對MMP-9 mRNA的降低作用更明顯，表達(dá)差異有顯著性(n=10，P< 0.01)，但對TIMP-1 mRNA表達(dá)的降低作用與rCC16干預(yù)組1比較，差異無顯著性表達(dá)(圖3)。與mRNA表達(dá)結(jié)果一致，免疫組化結(jié)果顯示，肺組織中MMP-9和TIMP-1蛋白質(zhì)主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，與正常組小鼠比較，COPD組小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加，表達(dá)差異有顯著性(n=10，P< 0.01)，rCC16干預(yù)后可以顯著降低MMP-9和TIMP-1 蛋白的表達(dá)，表達(dá)差異有顯著性(n=10，P< 0.01)，我們還發(fā)現(xiàn)，rCC16對小鼠肺組織中MMP-9的表達(dá)有劑量依賴性，而對TIMP-1 表達(dá)的降低作用沒有劑量依賴關(guān)系(圖4-5)。

圖2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變(H&E染色，×200)Figure 2 Histological changes of the lung tissues in mice of different groups(H&E staining, ×200)

注：A: MMP-9 mRNA相對表達(dá)量；B: TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量；C: RT-qPCR擴(kuò)增MMP-9、TIMP-1產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNA Marker,1～4分別為對照組、COPD模型組、rCC16劑量組1和rCC16劑量組2的PCR產(chǎn)物。圖3 RT-qPCR檢測rCC16對香煙誘導(dǎo)小鼠COPD模型肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響Note. A: Relative mRNA expression of MMP-9. B: Relative mRNA expression of TIMP-1. C: Agarose gel electrophoresis of MMP-9 and TIMP-1 RT-qPCR amplification products. M: DNA Marker, 1 ～ 4: PCR products of the control group, COPD group, rCC16 treatment 1 group and rCC16 treatment 2 group, respectively. Figure 3 RT-qPCR detection of the effect of rCC16 on the mRNA expressions of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of the cigarette-induced mouse COPD models

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測rCC16對香煙誘導(dǎo)小鼠COPD模型肺組織MMP-9(A-D)及TIMP-1(E-H)表達(dá)的影響 (×400)Figure 4 Immunohistochemical detection of the effect of rCC16 on protein expression of MMP-9 (A-D) and TIMP-1(E-H) in lung tissue of the cigarette-induced mouse COPD models (×400)

注：A: MMP-9陽性細(xì)胞平均灰度值; B: TIMP-1陽性細(xì)胞平均灰度值。圖5 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1 免疫組化陽性表達(dá)灰度分析Note. A: The average gray value of MMP-9 positive cells. B: The average gray value of TIMP-1 positive cells.Figure 5 Gray analysis of positive expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of mice in different groups

3 討論

目前，COPD居全球病死原因第4位，且隨著工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，造成空氣污染(如霧霾)的頻發(fā)，導(dǎo)致COPD的發(fā)病率及死亡率逐年上升，世界衛(wèi)生組織估計，至2020 年COPD 將位居世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第5位，全球病死原因的第3位[8]。COPD的臨床特點(diǎn)主要為慢性炎癥反應(yīng)所引起的呼吸道的損傷?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)又稱為明膠酶，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，破壞肺部結(jié)構(gòu)，參與氣道重塑。臨床實(shí)驗發(fā)現(xiàn)在COPD 患者的痰液和支氣管灌洗液中MMP-9的含量明顯增高[9]。TIMP也是由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可以特異性的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。TIMP-1和MMP-9以一定的比例(1∶1)形成聚合體，從而使酶的活性降低[10]。兩者之間的動態(tài)平衡是維持ECM的關(guān)鍵，是呼吸道和肺部損傷及修復(fù)的標(biāo)志[11]。

克拉拉細(xì)胞沿氣道對稱分布的無纖毛柱狀上皮細(xì)胞，CC16是其主要的合成并分泌的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，在肺部炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2]。我們前期的體外研究顯示，rCC16蛋白質(zhì)可以降低脂多糖誘導(dǎo)的大鼠氣道上皮細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)[6]。組成大鼠和小鼠CC16蛋白質(zhì)的氨基酸具有89.58%的一致性，rCC16可以作用于小鼠來源的巨噬細(xì)胞，減少由脂多糖誘導(dǎo)的炎性因子腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8[12-13]。此外，被動吸煙還可導(dǎo)致實(shí)驗動物如大鼠氣道上皮Clara細(xì)胞及其分泌蛋白(CC16)的減少[14]。然而，rCC16干預(yù)能否減輕COPD實(shí)驗動物模型中肺組織的損傷及對MMP-9的表達(dá)有所影響還未見研究。本實(shí)驗采用被動吸煙法成功構(gòu)建了小鼠COPD模型，應(yīng)用rCC16進(jìn)行滴鼻干預(yù)治療。研究結(jié)果顯示COPD組的小鼠肺泡的完整性出現(xiàn)了明顯的破壞，融合形成較大的肺泡， rCC16干預(yù)后，上述表現(xiàn)有所改善，且高劑量組較低劑量組的作用明顯，即具有劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步我們分析了肺組織MMP-9和TIMP-1的表達(dá)，RT-PCR和免疫組化均顯示rCC16可以降低COPD組小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。有趣的是rCC16對MMP-9和TIMP-1表達(dá)的抑制作用主要體現(xiàn)在氣道上皮細(xì)胞，而對肺泡上皮細(xì)胞中二者的表達(dá)則沒有影響，且rCC16對MMP-9的調(diào)節(jié)具有劑量依賴性，而對TIMP-1的調(diào)節(jié)并不具有劑量依賴關(guān)系，這可能是因為氣道上皮細(xì)胞通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將rCC16攝取后調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-ΚB的轉(zhuǎn)錄活性而直接影響MMP-9的表達(dá)[6, 15]，而rCC16調(diào)節(jié)TIMP-1的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

CC16作為藥物具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如體積小、易通過人工重組獲得、對酶、溫度、酸堿等變化的穩(wěn)定性好，這些特點(diǎn)成為臨床用藥的巨大優(yōu)勢。前期的研究證明大鼠CC16蛋白質(zhì)能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)炎癥反應(yīng)[12]，表明其生物學(xué)活性不僅僅局限于大鼠，但該研究僅為體外實(shí)驗。COPD動物模型的建立主要有空氣污染(特別是二氧化硫)、被動吸煙和呼吸道感染(主要是細(xì)菌)等[16]。本文在研究中選用小鼠被動吸煙法制備COPD模型，就是要在體內(nèi)實(shí)驗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)大鼠rCC16蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。我們的實(shí)驗表明，重組CC16蛋白質(zhì)可以減輕COPD小鼠肺組織損傷，通過影響MMP-9和TIMP-1的表達(dá)來改善肺組織的氣道重塑，為CC16在臨床作為干預(yù)氣道炎癥疾病的應(yīng)用提供了實(shí)驗依據(jù)。