劉敏，何興，蒲曉華，張雨，陳炳宇，黃四洲

(1. 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610500； 2. 成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，成都 610500； 3. 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室；發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610500)

在胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化兩個(gè)重要過程[1]。在細(xì)胞周期過程中，小染色質(zhì)復(fù)合體(MCM2-MCM7)在DNA復(fù)制起始中起著重要的作用[2]。在細(xì)胞周期M期到G1期的轉(zhuǎn)換期，通過ORC、CDC6和 CDT1等的介導(dǎo)作用，MCM復(fù)合體首先結(jié)合于DNA復(fù)制原點(diǎn)處。然后在G1和S期轉(zhuǎn)換期形成前復(fù)制復(fù)合體(pre-RC)以啟始DNA的復(fù)制。在MCMs復(fù)合體形成初始階段，MCM2-7以一種非活性的六聚體形式環(huán)抱雙聯(lián)DNA(dsDNA)[3-4]。到G1與S期轉(zhuǎn)換時(shí)，在DKK調(diào)控下Cdc45和GINS與MCM復(fù)合體發(fā)生結(jié)合以形成2CMG(Cdc45-MCM-GINS)復(fù)合體，從而使得MCM復(fù)合體的解旋酶活性得以激活[5]，起始DNA復(fù)制。MCM3是MCM家族的重要成員之一,最近直接被證實(shí)對于ORC/CDC6/CDT1/MCM2-7復(fù)合體的形成起著至關(guān)重要的作用[6]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MCM3磷酸化使得細(xì)胞周期不能通過細(xì)胞周期鑒定點(diǎn)[7]，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期不能正常進(jìn)行。另一方面作為MCM家族成員之一的MCM3， 在胚胎發(fā)育早期被認(rèn)作是增殖細(xì)胞的重要標(biāo)記基因， 當(dāng)細(xì)胞周期減慢時(shí)，其表達(dá)降低，而在終末分化細(xì)胞中，MCM3不容易被檢測到[8]。相應(yīng)的在肝癌、宮頸癌等眾多快速增殖的癌癥細(xì)胞中，MCM3、Ki67及PCNI等增殖標(biāo)記基因均呈高表達(dá)[9-12]。因此MCM3也被用作在胚胎發(fā)育及疾病發(fā)生中細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記基因。

MCM家族作為細(xì)胞周期DNA復(fù)制起始的調(diào)控因子及增殖細(xì)胞的標(biāo)記基因已被廣泛研究。但在增殖細(xì)胞中MCM家族的表達(dá)量遠(yuǎn)大于DNA復(fù)制所必須，暗示該家族成員在胚胎發(fā)育過程中可能參與了DNA復(fù)制以外的其他生物學(xué)功能[13-14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中家族成員之一mcm2作為foxn1的下游基因調(diào)控了胸腺T細(xì)胞的增殖[15]；mcm5也可能通過非細(xì)胞周期依賴性方式調(diào)控了體節(jié)極性的決定[16]；在小鼠中過量表達(dá)的MCM3也被證實(shí)在發(fā)育環(huán)境壓力下保證了紅細(xì)胞的成熟[17]。這些研究均表明MCM家族成員在胚胎發(fā)育過程中確實(shí)起著重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)mcm3在斑馬魚中存在母源性mcm3及合子基因mcm3。斑馬魚胚胎過表達(dá)母源性基因mcm3導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，尾部發(fā)育缺失[18]，但是合子基因mcm3在發(fā)育中作用仍不清楚。

斑馬魚有體外受精、遺傳操作簡單、早期胚胎透明、發(fā)育迅速的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用到器官發(fā)育的研究中[19-20]。本研究首先研究斑馬魚合子基因mcm3在胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)mcm3在肝等內(nèi)胚層器官前體細(xì)胞中大量表達(dá)，暗示其可能參與了肝發(fā)育。進(jìn)一步運(yùn)用MO注射敲降及mRNA回救的方法研究發(fā)現(xiàn)，合子基因mcm3功能敲降使得肝變小，并且這種表型可以較好的被mcm3 mRNA回救。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)mcm3功能敲降并不影響心臟和血管的發(fā)育，暗示mcm3特異的參與了肝發(fā)育的早期調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本文所用斑馬魚品系包括野生型(AB品系)和Tg(Ifabp10:GFP)，Tg(flk1:GFP)，Tg(cmlc2:GFP)三種轉(zhuǎn)基因品系。三種轉(zhuǎn)基因品系由黃紅輝教授和孫華欽老師贈送。斑馬魚嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)[21]，實(shí)驗(yàn)胚胎在28.5℃孵育箱中孵育至實(shí)驗(yàn)所需日期。

1.1.2 試劑與儀器

探針合成試劑盒為DIG RNA Labeling kit(Roche)；Mopholino購自GeneTools公司(mcm3MO：5-AAAAGTTCAGTGCAGAACACCTCGT-3；ContMO：5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3)；mRNA合成試劑盒為mMessage mMachine SP6 (Ambion-Thermo Fisher)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Reverse Transcription (#K1622,Thermo)；原位雜交試劑盒(Roche)；限制性內(nèi)切酶及Q5高保真酶(NEB)；PCR purification kit (D6492-01,Qiagen)；拍照所用顯微鏡主要為Olympus SZX2-ILLT和Olympus U-HGLGPS熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 MO和mRNA注射

利用mMessage mMachine SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion-Thermo Fisher, UK)體外合成了注射用斑馬魚的全長mcm3 mRNA。將mcm3 MO(300 μmol/L)和mRNA (100 ng/μL)分別或共注射于1～4細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中。

1.2.2 探針制備與原位雜交

用線性化載體或PCR產(chǎn)物為模板，使用sp6或T7轉(zhuǎn)錄酶合成地高辛標(biāo)記的RNA反義探針(DIG RNA Labeling kit試劑盒)。純化及電泳鑒定正確后，于-20℃保存?zhèn)溆?。目的胚胎收集并?%PFA固定過夜，第2天用PBST洗3次(每5 min 1次)，無水甲醇脫水3次(每次15 min)，最后放入-20℃?zhèn)溆谩Ｔ浑s交流程按之前的報(bào)道方法進(jìn)行[16]。

1.2.3mCherrymRNA和mcm5 mRNA的合成

用限制性內(nèi)切酶將構(gòu)建好的質(zhì)粒酶切線性化，使用DNA純化試劑盒回收線性化的DNA模板。后用mMessage mMachine SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA, 再使用酚氯仿抽提mRNA，異丙醇沉淀。測濃度后跑膠檢測并分裝放于-80℃冰箱保存待用。

1.2.4 熒光體視顯微鏡拍照

活體胚胎用麻醉劑trican麻醉后拍照，原位雜交及其他需要定位的胚胎將胚胎放于100%甘油或1%低熔點(diǎn)瓊脂凝膠中固定，后使用Olympus SZX2-ILLT或Olympus U-HGLGPS熒光顯微鏡觀察及拍照。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚合子基因mcm3在胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)模式

為研究合子基因mcm3在斑馬魚發(fā)育早期中的作用及功能，我們運(yùn)用整胚原位雜交檢測mcm3基因在斑馬魚中的時(shí)空表達(dá)模式。研究表明，mcm3在胚胎中囊胚轉(zhuǎn)換前未見表達(dá)(圖1D)，在bud時(shí)期及以前mcm3廣泛表達(dá)(圖1A)。在體節(jié)發(fā)生期到24 hpf，mcm3基因廣泛表達(dá)于頭部，眼睛，體節(jié)以及內(nèi)胚層區(qū)域(圖1B)。受精后48 h～4 d(圖1C，E-G)，mcm3基因在頭部，魚腮及胸腺等區(qū)域高表達(dá)，且在肝等內(nèi)胚層組織器官有較強(qiáng)的表達(dá)(箭頭所指)。以上數(shù)據(jù)表明，合子基因mcm3在胚胎早期發(fā)育過程中可能參與了肝內(nèi)胚器官發(fā)育的調(diào)控。

注：A-G. mcm3在胚胎各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式。mcm3在4細(xì)胞期不表達(dá)(D)，在bud時(shí)期呈廣泛表達(dá)(A)。在24 hpf mcm3主要表達(dá)在頭部、眼睛及內(nèi)胚層區(qū)域(B，箭頭所示)；在48 hpf 主要在眼睛、中后腦邊緣、腮及內(nèi)胚層表達(dá)(C); 在72 hpf之后主要在腮、中后腦邊緣及部分內(nèi)胚層組織表達(dá)(E-G)。圖1 mcm3在斑馬魚發(fā)育早期的表達(dá)模式Note. A-G. The expression pattern of mcm3. mcm3 was not expressed in the 4-cell stage (D), it was expressed ubiquitously in the bud stage (A), while the expression was restricted in the head, eye and endoderm related tissues at 24 hpf. At 48 hpf, it was dominantly expressed in the eye, the boundary of mid-hindbrain, gill and endoderm tissues (C). After 72 hpf, mcm3 was only expressed in the boundary of mid-hindbrain, gill and partial part endoderm tissues (E-G).Figure 1 Expression pattern of mcm3 in early development of zebrafish

注：A. 標(biāo)記mcm3 MO所對應(yīng)的基因位點(diǎn)；B. mCherry mRNA的設(shè)計(jì)策略；C. 單獨(dú)注射mCherry mRNA及共注射mCherry mRNA和mcm3 MO后胚胎熒光表達(dá)圖。圖2 mcm3 MO設(shè)計(jì)及功能驗(yàn)證Note. A. Gene locus of mcm3 MO. B. Design strategy of mCherry mRNA. C. Fluorescence image of embryos after injection of mCherry mRNA alone and co-injection of mCherry mRNA and mcm3 MO.Figure 2 mcm3 MO designing and functional verification

2.2 合子基因 mcm3 MO的設(shè)計(jì)及功能驗(yàn)證

為研究mcm3敲降后是否影響胚胎早期內(nèi)胚層肝的發(fā)育，我們合成了mcm3 MO以阻斷胚胎內(nèi)源性mcm3 mRNA的翻譯(圖2A)。與此同時(shí)，構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄的mCherry mRNA的載體以驗(yàn)證mcm3 MO是否工作。在該載體中于mCherry編碼區(qū)的上游添加了一段完全與mcm3 MO相匹配的DNA序列，體外轉(zhuǎn)錄后獲得mCherrymRNA可與mcm3 MO相結(jié)合(圖2B)。如果合成的mcm3 MO能很好地抑制內(nèi)源性mcm3 mRNA的翻譯， 理論上mCherrymRNA的翻譯也將受到mcm3 MO的抑制而表達(dá)減弱。結(jié)果顯示，單獨(dú)注射了mCherrymRNA的野生型胚胎，在Shield到70%外卵黃外包時(shí)期有較強(qiáng)的紅色熒光。而共注射了mcm3 MO以及mCherrymRNA的胚胎中，紅色熒光明顯減弱(圖2C)。以上結(jié)果間接表明，體外合成的mcm3 MO能很好的抑制胚胎內(nèi)源性mcm3 mRNA翻譯。

2.3 合子基因mcm3在肝發(fā)育中的作用

肝是內(nèi)胚層來源的重要器官，為驗(yàn)證是否mcm3參與了肝的發(fā)育調(diào)控，我們在Tg(fapb10：GFP)轉(zhuǎn)基因中注射mcm3 MO以阻斷mcm3翻譯來分析肝發(fā)育是否受到影響。結(jié)果表明，在mcm3功能敲降后胚胎發(fā)育早期沒有任何缺陷(數(shù)據(jù)未提供)。待胚胎發(fā)育到第3天與對照組相比，眼睛稍微變小(圖3 A，箭頭)，但無明顯的其他外觀發(fā)育缺陷(圖3A)。仔細(xì)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 當(dāng)mcm3功能敲降時(shí)3.5 d胚胎肝明顯變小，只有正常胚胎肝的1/10左右(圖3B)。為證實(shí)mcm3在肝發(fā)育中的特異性作用，我們在Tg(flk1:GFP)及Tg(cmlc2:GFP)轉(zhuǎn)基因胚胎中注射mcm3 MO以敲降mcm3以分析血管和心臟的發(fā)育是否受到影響，但并未發(fā)現(xiàn)血管和心臟發(fā)育的明顯異常(圖3C-D)。以上結(jié)果表明，mcm3對胚胎早期肝的發(fā)育具有特異的正調(diào)控作用。

2.4 合子基因mcm3 mRNA對肝表型的回救

為驗(yàn)證mcm3在肝發(fā)育中的特異性作用，我們分析mcm3 mRNA是否能回救mcm3 MO注射導(dǎo)致的肝變小的表型。結(jié)果顯示，與單獨(dú)注射mcm3 MO的胚胎相比，共注射mcm3 MO及mRNA的Tg(lfabp10:GFP)胚胎在3.5 d時(shí)肝明顯變大，表型得到回救(圖4A，a1-a4，白色箭頭)，這表明mcm3特異的參與了肝早期發(fā)育的調(diào)控。由于轉(zhuǎn)基因背景的胚胎可能導(dǎo)致部分非特異性表型，為了進(jìn)一步證實(shí)mcm3在肝早期發(fā)育中的作用，我們在野生型胚胎中檢測肝發(fā)育早期的另一內(nèi)源性標(biāo)記基因cp。結(jié)果表明，在mcm3功能敲降時(shí)肝標(biāo)記基因cp表達(dá)面積明顯減小(圖4B，b1-b2)，并且mcm3 RNA注射較好的回救了mcm3MO注射所導(dǎo)致的肝發(fā)育缺陷(圖4C，c1-c3)。

注：A. 在胚胎發(fā)育第3天時(shí)注射mcm3 MO的胚胎眼睛稍微變小，但無其他任何畸形；B.與對照組比較mcm3功能敲降后肝明顯變小(白色箭頭標(biāo)注)；C,D. mcm3功能敲降后血管(C)和心臟(D)發(fā)育正常。標(biāo)尺：100 μm。圖3 mcm3敲降后肝變小Note. A. On the third day of embryonic development, the embryo injected with mcm3 MO had a smaller eye but no other abnormalities. B. Compared with the control group, the liver was smaller after mcm3 knockdown (white arrow). C, D. After mcm3 knockdown, blood vessels (C) and heart (D) were developed normally. Bar=100 μm.Figure 3 Liver is smaller after mcm3 knockdown

注：A. 在單獨(dú)注射control MO(a1)、mcm3 MO(a2)、mcm3 mRNA(a3)、共注射mcm3 MO和mcm3 mRNA(a4)的Tg(fabp10：GFP)轉(zhuǎn)基因胚胎中肝的比較；B. 在野生型胚胎中，注射mcm3 MO導(dǎo)致胚胎肝變?。籆. 在野生型胚胎中mcm3 mRNA注射回救了注射mcm3 MO胚胎中的肝發(fā)育缺陷。標(biāo)尺：100 μm。圖4 mcm3 mRNA注射回救了mcm3 MO注射后的肝發(fā)育缺陷Note. A. Comparison of liver in the Tg (fabp10:GFP) transgenic embryos with control MO (a1), mcm3 MO (a2), mcm3 mRNA (a3), co-injection of mcm3 MO and mcm3 mRNA (a4). The liver in Tg(fabp10：GFP)embryos injected with control MO (a1), mcm3 MO (a2), mcm3 mRNA (a3), respectively, as well as embryos co-injected with mcm3 MO and mcm3 mRNA (a4). B. In the wild-type embryos, injection of mcm3 MO resulted in a smaller liver than the control embryos. C. In wild-type embryos, mcm3 mRNA was injected to rescue the liver development defects caused by injection of mcm3 MO. (arrow). Bar=100 μm.Figure 4 mcm3 mRNA rescued the liver development defects caused by mcm3 MO injection

3 討論

雖然MCM家族在細(xì)胞周期中調(diào)控DNA復(fù)制的功能已經(jīng)很清楚，但是其在胚胎發(fā)育中的功能報(bào)道較少。在小鼠中MCM3功能敲除使得紅細(xì)胞不能正常成熟，血液干細(xì)胞功能缺陷[17]，但其在其他增殖細(xì)胞中的功能未見報(bào)道。我們課題組運(yùn)用斑馬魚模式動物研究的優(yōu)勢，對合子基因mcm3在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)模式以及其在肝發(fā)育中的功能進(jìn)行了研究。表達(dá)模式表明合子mcm3全長基因表達(dá)模式與我們已經(jīng)報(bào)道的mcm5的表達(dá)有許多相似的地方[16]：在體節(jié)期前廣泛表達(dá)，而后在體節(jié)、肌肉、神經(jīng)、內(nèi)胚層細(xì)胞處高表達(dá)。但以mcm3編碼區(qū)的 5’端500 bp片段為探針進(jìn)行原位雜交檢測，發(fā)現(xiàn)mcm3在體節(jié)發(fā)生晚期及24 hpf只在體節(jié)大量表達(dá)，而在頭部等區(qū)域表達(dá)很弱(數(shù)據(jù)未提供)，暗示合子mcm3可能存在另一個(gè)或多個(gè)不同的同源基因或者不同的剪切方式。最近有研究報(bào)道斑馬魚mcm3存在著母源性和合子轉(zhuǎn)錄兩種類型[21]。 研究發(fā)現(xiàn)母源性mcm3基因過表達(dá)直接導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，并且胚胎發(fā)育到24 h時(shí)尾部出現(xiàn)不同程度的變短或缺失，而過表達(dá)合子基因mcm3后的胚胎發(fā)育缺陷未見報(bào)道[21]。這些研究暗示在胚胎發(fā)育過程中， 在斑馬魚中可能mcm3較其他mcm家族因子其調(diào)控發(fā)育的具體過程及分子機(jī)制有一定不同之處，這為我們研究MCM家族細(xì)胞周期因子在發(fā)育中的功能開辟了一條新的道路。

在這里我們的研究表明mcm3調(diào)控了肝發(fā)育，但在調(diào)控肝發(fā)育過程中mcm3是通過細(xì)胞周期依賴還是非依賴的形式進(jìn)行還不得而知；mcm3是否也調(diào)控了其他內(nèi)胚層及外胚層組織的發(fā)育調(diào)控也有待我們后續(xù)的工作進(jìn)一步闡明。