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二苯乙烯苷抑制NADPH氧化酶對小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

2019-04-28 03:29薛威唐虹孫雨倩江勤黃大可董六一
關(guān)鍵詞:苯乙烯腦缺血腦組織

薛威,唐虹,孫雨倩,江勤,黃大可,董六一*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室 抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實(shí)驗(yàn)室; 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院; 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,合肥 230032)

腦卒中是具有高發(fā)病率和死亡率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一,嚴(yán)重威脅人類健康,80%的腦卒中是缺血性的[1-2]。腦缺血后,再灌注會(huì)進(jìn)一步加重腦組織損傷,據(jù)報(bào)道,缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制是氧化應(yīng)激[3-4]。氧化應(yīng)激的主要原因是ROS的積累,過度的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞膜和線粒體膜的損傷,以及DNA的降解,最終促使細(xì)胞凋亡[5]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是腦I/R損傷中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源。中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的NOX有 NOX1、NOX2、NOX4,而NOX4在腦I/R損傷中扮演著最為重要的角色[6]。參與氧化應(yīng)激的主要ROS包括超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基,而NOX4主要產(chǎn)生過氧化氫[7]。因此,降低NOX4的水平對于腦I/R損傷具有很大的治療意義。

二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)是中藥何首烏中特有的具有顯著藥理活性的水溶性有效成分,研究表明其具有抑制粥樣硬化、防治老年性癡呆、抗腫瘤、保護(hù)腦組織等多種功能[8-10]。吳曉玲等[11]研究發(fā)現(xiàn):TSG可以提高大鼠體內(nèi)SOD含量和降低MDA含量減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷。梅勁春等[12]發(fā)現(xiàn):用TSG治療大鼠糖尿病腎病后,氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS及MDA水平降低,SOD水平升高,腎間質(zhì)纖維化減輕。這些研究結(jié)果提示,TSG可清除氧自由基,可有效對抗氧化應(yīng)激損傷,具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究主要探討TSG是否通過抑制NOX4的活性從而減輕小鼠腦I/R后的氧化應(yīng)激損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡SPF級雄性KM小鼠,體重22 ~ 24 g,購于安徽醫(yī)科大學(xué)省級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(皖)2011-002】,飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(皖)2011-007】,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。溫度范圍22 ± 3℃,濕度范圍:40% ~ 70%,照明周期:12 h明/12 h暗,自由攝水進(jìn)食。

1.1.2 藥品與試劑

二苯乙烯苷(純度:98%,批號:20170502,南京道斯夫生物科技有限公司,中國),水合氯醛(批號:T20150610,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國),0.9%氯化鈉注射液(批號:170705074,上海華源制藥股份有限公司,中國),RIPA蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology,中國),PMSF(Sigma公司,美國),BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology,中國),SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology,中國),預(yù)染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司,美國),兔來源NOX4一抗、兔來源cleaved caspase-3/9 一抗、內(nèi)參β-actin(CST公司,美國),辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG二抗和山羊抗兔lgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,中國),SuperSignal West Femto高靈敏度發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,美國)。

1.1.3 儀器設(shè)備

超低溫冰箱(Sanyo Electric CO. Ltd,日本),TGL-16H高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品,中國),DIAX-900內(nèi)切式組織勻漿機(jī)(Heidolph公司,德國),TE300 型倒置顯微鏡(Nikon 公司,日本),SpectraMax190酶標(biāo)儀(Molecular Devices,USA),石蠟切片機(jī)(Leica,德國),WD-9405B水平搖床(北京市六一儀器廠,中國),Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器公司,中國),JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波譜儀(日本電子,日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性腦缺血再灌注損傷模型建立

將100只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組、模型組、二苯乙烯苷劑量組(3、6、12 mg/kg),每組20只,給藥體積為0.01 mL/g。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,進(jìn)行手術(shù)造模。所有小鼠術(shù)前禁食不禁水12 h。小鼠放入麻醉箱中給予1.33%(一個(gè)肺泡濃度)的異氟烷麻醉15 min后固定,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,并穿以6號線。在結(jié)扎之前將給藥組小鼠通過尾靜脈注射TSG一次,隨即結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈30 min后再經(jīng)尾靜脈注射給藥一次,結(jié)扎2 h后,松開絲線進(jìn)行再灌,24 h后處死小鼠。假手術(shù)組僅做頸動(dòng)脈分離,不做結(jié)扎處理,且假手術(shù)組和模型組僅給予等量的生理鹽水。

1.2.2 病理組織學(xué)檢查

小鼠腦缺血再灌注后,處死取腦,每組取4個(gè)小鼠腦組織置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)石蠟包埋制成切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,BX-51型正置顯微鏡觀察小鼠腦組織病理變化。

1.2.3 腦組織氧自由基檢測

小鼠造模成功后,頸椎脫臼處死,取出大腦(去除小腦和腦干,每組8個(gè)小鼠大腦),迅速將缺血區(qū)腦組織裝入內(nèi)徑2 mm的薄壁聚乙烯塑料管中,并迅速放入液氮中待測。將JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波譜儀諧振腔溫度調(diào)整到130 K,從液氮中取出腦組織標(biāo)本迅速放入ESR諧振腔內(nèi),測試ESR波譜,利用專用軟件分析氧自由基信號情況。

1.2.4 DHE染色法檢測腦組織中ROS水平

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃保存的染色液(reagent B)放入冰槽里融化,稀釋液(reagent C)置于室溫預(yù)熱。移出10 μL染色液(reagent B)到新的1.5 mL離心管,加入990 μL稀釋液(reagent C),混勻后,配成染色工作液,避光待用。小鼠缺血再灌注后,斷頭取腦(每組4個(gè)小鼠大腦),用冰凍切片機(jī)切制成10 μm的冰凍切片,小心加上500 μL預(yù)冷的清理液(reagent A),鋪滿整個(gè)切片表面。移去切片上的清理液(reagent A)后,加上200 μL室溫預(yù)熱的染色工作液,在37℃濕潤培養(yǎng)箱里,孵育20 min。避光除去染色工作液后,在整個(gè)切片表面加上500 μL清理液(reagent A),除去切片上的清理液(reagent A)后封片,即刻在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

采用 Western blot分別檢測小鼠缺血側(cè)大腦皮層組織中NOX4通路相關(guān)蛋白和caspase-3/9 蛋白表達(dá)的變化(每組4個(gè)小鼠大腦)。利用Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影后,使用Image J分析軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織病理學(xué)變化的影響

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖1),假手術(shù)組小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊,形態(tài)正常且細(xì)胞數(shù)較多。模型組小鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少,疏松呈網(wǎng)狀(黃色箭頭所示),胞核深染(紅色箭頭所示)等病理性改變。TSG高、中劑量治療組能夠明顯減輕小鼠腦皮層神經(jīng)元的病理性損傷,增加神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量,改善神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài),減輕核固縮。TSG低劑量組神經(jīng)元的病理性損傷未得到明顯改善。

2.2 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中氧自由基代謝的影響

結(jié)果見表1,與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腦組織中氧自由基生成明顯增加,其氧自由基信號值與假手術(shù)組比較呈顯著性差異(P< 0.01);與模型組比較,TSG 12.0、6.0、3.0 mg/kg 可顯著抑制小鼠腦組織氧自由基生成,其氧自由基信號值顯著下降(P< 0.01或P< 0.05)。

注:A.假手術(shù)組;B.I/R組;C.TSG(12.0 mg/kg)組;D.TSG(6.0 mg/kg)組;E.TSG(3.0 mg/kg)組。圖1 TSG對小鼠腦I/R損傷后大腦皮層腦組織病理學(xué)損傷的影響(×200)Note. A: Sham group. B: I/R group. C: TSG(12.0 mg/kg)group. D: TSG(6.0 mg/kg)group. E: TSG(3.0 mg/kg)group.Figure 1 Effects of TSG on pathological damages in brain tissues after I/R injury in the mice(×200)

表1 二苯乙烯苷對小鼠腦I/R損傷后腦組織氧自由基代謝的影響Table 1 Effects of TSG on metabolism of oxygen free radicals in brain tissue after cerebral I/R injury in the

注:##P< 0.01 vs假手術(shù)組;*P< 0.05,**P< 0.01 vs模型組(I/R)。

Note.##P<0.01, vs the sham group.*P< 0.05,**P< 0.01, vs the model (I/R) group.

2.3 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中ROS水平的影響

DHE 染色結(jié)果顯示,小鼠腦缺血再灌注后,與假手術(shù)組相比,模型組小鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)ROS水平顯著增加, TSG (12.0、6.0、3.0 mg/kg) 劑量組小鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)ROS水平較模型組顯著降低。提示TSG 可抑制缺血再灌注損傷小鼠大腦皮質(zhì)ROS的生成。(見圖2)

2.4 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中NOX4蛋白表達(dá)的影響

小鼠腦缺血再灌注24 h后與假手術(shù)組相比,模型組小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P< 0.01),TSG 12.0 mg/kg和6.0 mg/kg 可顯著抑制小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白的表達(dá),減輕小鼠腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果提示TSG可抑制缺血再灌注損傷小鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)NOX4蛋白表達(dá)的增高。(見圖3)

注: ##P < 0.01 vs假手術(shù)組;*P <0.05,**P < 0.01 vs模型組(I/R)。圖3 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中NOX4蛋白表達(dá)的影響Note. ##P < 0.01 vs the sham group. *P < 0.05,**P <0.01 vs the model (I/R) group.Figure 3 Effects of TSG on the expression of NOX4 protein in brain tissue after I/R injury in the mice

2.5 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

小鼠腦缺血再灌注24 h后,與假手術(shù)組相比,模型組小鼠缺血區(qū)皮層組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3/9活化增加,剪切后的caspase-3/9蛋白表達(dá)顯著增多(P< 0.01),TSG 12.0 mg/kg可顯著抑制小鼠缺血區(qū)皮層組織凋亡蛋白caspase-3/9的活化,從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。(見圖4)

3 討論

二苯乙烯苷(TSG)化學(xué)名為2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,其結(jié)構(gòu)與白藜蘆醇相似,僅二位多一個(gè)酚羥基并形成了糖苷,均屬于二苯乙烯類[13]。在心腦血管方面,Liu等[14]發(fā)現(xiàn)TSG的酚羥基通過給出氫原子,自身形成二聚體,從而清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基,進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。此外,TSG可以抑制腦I/R所導(dǎo)致的NMDA受體結(jié)合力及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高,具有腦保護(hù)作用。

大量研究表明,腦缺血后再灌注會(huì)進(jìn)一步加重腦組織損傷,抑制再灌注損傷是治療缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)[15-16]。盡管缺血性損傷的病理生理學(xué)是復(fù)雜且多因素的,但廣泛的研究表明氧化應(yīng)激在I/R損傷中起著重要作用。本研究采用小鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型觀察TSG對腦I/R損傷的作用,結(jié)果顯示,TSG可以減輕腦I/R造成的腦組織病理性損傷,同時(shí)可減少腦組織中氧自由基含量,提示TSG對小鼠腦I/R損傷有保護(hù)作用。

注: ##P <0.01 vs假手術(shù)組;*P < 0.05,**P < 0.01 vs模型組(I/R)。圖4 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中cleaved caspase-3/9蛋白表達(dá)的影響Note.##P< 0.01 vs the sham group. *P < 0.05,**P < 0.01 vs the model (I/R) group.Figure 4 Effects of TSG on the expressions of cleaved caspase-3/9 proteins in brain tissues after I/R injury in the mice

腦缺血再灌注會(huì)引發(fā)一系列病理損傷,如興奮性毒性,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷[17],在這些病理事件中,氧化應(yīng)激已經(jīng)成為治療腦血管疾病的主要挑戰(zhàn)[18]。大腦中ROS生成涉及許多生物過程,主要來源包括線粒體呼吸鏈,黃嘌呤氧化酶和環(huán)氧合酶,最近的研究表明,NOX也是重要的ROS生產(chǎn)者。Serrano等[19]研究發(fā)現(xiàn):NOX表達(dá)和活性在缺血性中風(fēng)后的神經(jīng)組織中升高。Qin 等[20]最近研究發(fā)現(xiàn):NOX抑制劑可減少缺血區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、縮小梗塞面積、減輕相應(yīng)區(qū)域功能損傷。本研究結(jié)果顯示,小鼠腦I/R后缺血區(qū)NOX4蛋白表達(dá)顯著上調(diào),TSG可顯著抑制小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白的表達(dá),減輕小鼠腦I/R引起的氧化應(yīng)激損傷。上述研究結(jié)果均提示了NOX在腦I/R的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,抑制NOX活性可能是減輕腦I/R的有效途徑。

Caspase 蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要參與者, 其中caspase-9是線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)者,而caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者[21]。Caspases-9的活性增高并自我剪切形成cleaved caspase-9,激活下游的caspase-3。凋亡早期caspase-3活化為cleaved caspase-3,裂解相應(yīng)胞質(zhì)胞核底物,切割核小體間的DNA,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果表明,TSG可以顯著抑制小鼠腦I/R引起的cleaved caspase-3/9 過度表達(dá),其作用機(jī)制可能是下調(diào)了NOX4蛋白的表達(dá),抑制ROS爆發(fā)性生成,從而抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放和線粒體膜電位(MMP)降低,避免線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子到胞質(zhì)激活Caspase系列蛋白。

總之,NOX4是腦I/R損傷中ROS的主要來源,下調(diào)NOX4可能是預(yù)防氧化應(yīng)激損傷的有效途徑。本研究結(jié)果顯示,TSG對小鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用可能與下調(diào)NOX4蛋白的表達(dá)有關(guān),具體的作用機(jī)制我們將做進(jìn)一步深入研究。

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