劉雪靜，王雪雯，石運(yùn)偉，王新，高煜，劉東1，*

(1. 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226001;2. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226001； 3. 南通大學(xué)教育部江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南通 226001)

近年來，組織再生研究取得了很大進(jìn)展，但對(duì)組織再生的理解與臨床需要仍有很大距離。各物種間再生能力差異很大[1]，與哺乳動(dòng)物相比，非哺乳類脊椎動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、硬骨魚類擁有良好的再生潛能，例如：斑馬魚(Daniorerio, zebrafish)作為模式動(dòng)物具有較強(qiáng)的再生能力，它的鰭[2]、心臟[3]、肝[4]、視網(wǎng)膜[5]、脊髓[6]和感覺毛細(xì)胞[7]在損傷后能夠再生，是研究再生問題的良好模型[8]。大量研究發(fā)現(xiàn)，組織再生過程中，F(xiàn)GF、Wnt、Notch、BMP、Hedgehog、IGF等信號(hào)通路參與其中[9-11]。然而，至今組織再生的信號(hào)調(diào)控機(jī)制還沒有被闡述清楚[12-15]。

組織再生過程中，涉及大量細(xì)胞的分裂、增殖生物學(xué)過程，因此，物質(zhì)代謝的調(diào)控對(duì)組織再生過程具有重要作用。其中，生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)是調(diào)控代謝的重要信號(hào)。GH是組織生長(zhǎng)和機(jī)體代謝中重要的肽激素，由垂體前葉合成并釋放，通過作用于特異性膜結(jié)合受體發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)功能[16]，因此在人類以及動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要的作用。GH通過與靶細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合激活MAPK/ERK通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分離和增殖[17]；此外，GH還可通過JAK/SATA途徑刺激胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)生成[17]，在此過程中肝是主要的靶器官并且是產(chǎn)生IGF-1的主要部位，產(chǎn)生的IGF-1對(duì)多種組織的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。GH缺乏或過量均能引起代謝紊亂，如巨人癥通常是由于垂體病變導(dǎo)致垂體腺瘤從而使生長(zhǎng)激素分泌過多引起的[18]。兒童GH缺乏的主要表現(xiàn)是生長(zhǎng)障礙，身材矮小和性成熟延遲。在成人中，生長(zhǎng)激素缺乏(GH deficiency, GHD) 將導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，使得骨骼更加脆弱，更容易發(fā)生病理性骨折和骨質(zhì)疏松癥[19]。

本文以斑馬魚為研究對(duì)象，通過 Gateway技術(shù)和 Tol2 系統(tǒng)建立轉(zhuǎn)基因系Tg(ubi:GH)。ubi 啟動(dòng)子來自于斑馬魚泛素基因的上游調(diào)控區(qū)，能夠誘導(dǎo)下游基因在全身各組織器官表達(dá)[20]，我們利用ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游GH在斑馬魚全身表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GH過表達(dá)能夠促進(jìn)斑馬魚尾鰭再生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本文中顯微注射以及外交所使用的斑馬魚均為野生型AB系斑馬魚，喂養(yǎng)和產(chǎn)卵方案依照ZFIN：The Zebrafish Book (http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)。

1.1.2 儀器設(shè)備

PV830顯微注射儀(World Precision Instruments)、手術(shù)器械(World Precision Instruments)、MVX10體視顯微鏡(Olympus)、MIR-154恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo)、T100TM Thermal Cycler PCR儀(Bio-Rad)、SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)、StepOnePlusTMReal-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

取6月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生型斑馬魚，麻醉至失去運(yùn)動(dòng)能力后置于培養(yǎng)皿中，于顯微鏡下橫切80%尾鰭。橫切尾鰭后的斑馬魚暫喂養(yǎng)在雜交缸中，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)。橫切尾鰭后每天記錄斑馬魚尾鰭再生情況，記錄至斑馬魚尾鰭再生完全(切除后15 d)。

通過 Ensembl 數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)查詢生長(zhǎng)激素基因(growth hormone)序列，合成重組質(zhì)粒 pME-GH，將其與 p5E-ubi、p3E-polyA 重組克隆到表達(dá)載體 pDestTol2CG2 中，獲得表達(dá)質(zhì)?！皃DestTol2CG2; ubi:GH-polyA”。將表達(dá)質(zhì)粒與transposase mRNA顯微注射到1細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，發(fā)育至48 h，在熒光顯微鏡下觀察篩心臟帶有綠色熒光的胚胎，培養(yǎng)至成魚(G0)。G0 與野生型 AB 系交配篩選出子一代(F1 代)。

1.2.2 qPCR檢測(cè)GH表達(dá)

分別收集48 hpf的野生型和轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎各10枚，加入1 mLTrizol提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，通過qPCR檢測(cè)分析GH的表達(dá)情況。利用Primer 3 在線引物設(shè)計(jì)工具(http://primer3.ut.ee)設(shè)計(jì)生長(zhǎng)激素基因GH和內(nèi)參基因ef1a的PCR引物為：GH-qPCR-L: 5’-ggtggtggttagtttgctgg-3’，GH-qPCR-R: 5’-caactgtctgcgttcctcag-3’； ef1a-L：5’-tgatctacaaatgcggtgga-3’，ef1a-R：5’-caatggtgataccac gctca-3’。

1.3 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)中使用體視顯微鏡自帶軟件對(duì)斑馬魚尾鰭生長(zhǎng)長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，分別選取背側(cè)、腹側(cè)以及中間部位的固定位置進(jìn)行測(cè)量并記錄數(shù)據(jù)。相關(guān)數(shù)據(jù)在 GraphPad Prism 5.0上利用 Student’sttest 進(jìn)行組間的差異分析，P< 0.05 具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(ubi: GH)

為研究GH過表達(dá)對(duì)斑馬魚尾鰭再生的影響，我們利用 Gateway技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)?！猵DestTol2CG2; ubi:GH-polyA(圖1A)，其中在心臟表達(dá)的綠色熒光蛋白用于篩選轉(zhuǎn)基因斑馬魚。在一細(xì)胞期顯微共注射表達(dá)質(zhì)?！皃DestTol2CG2; ubi:GH-polyA”和轉(zhuǎn)座酶 mRNA(圖1B)，發(fā)育至48 h，通過熒光顯微鏡下篩選出在心臟組織特異性表達(dá)綠色熒光蛋白斑馬魚胚胎(圖1C)，培養(yǎng)至成年，與AB系野生型斑馬魚交配產(chǎn)生F1代，篩選出心臟表達(dá)綠色熒光蛋白的斑馬魚，繼續(xù)培養(yǎng)至成年，用于斑馬魚尾鰭再生實(shí)驗(yàn)。如圖1D所示，qPCR檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)心臟表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中GH表達(dá)顯著高于野生型斑馬魚(P< 0.05)。成年后，轉(zhuǎn)基因斑馬魚也比野生型體積大(圖1E)。

注：A. GH表達(dá)質(zhì)粒示意圖。B. 在斑馬魚胚胎一細(xì)胞期共注射GH過表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mRNA。C. 48hpf，轉(zhuǎn)基因斑馬魚心臟表達(dá)綠色熒光蛋白。D. qPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚中GH的表達(dá)，*P=0.0123 < 0.05。E. 過表達(dá)生長(zhǎng)激素的成年轉(zhuǎn)基因斑馬魚比野生型體積大。圖1 建立轉(zhuǎn)基因系 Tg(ubi: GH)Note. A. Schematic representation of the “pDestTol2CG2; ubi:GH-polyA” vector fragment. B. Co-injection of GH overexpression vector and transposase mRNA in one cell stage. C. The green fluorescent protein was detected the in heart of transgenic zebrafish at 48 hpf. D. The expression of GH was detected by qPCR in the transgenic zebrafish.*P=0.0123 < 0.05. E. Transgenic zebrafish overexpressing GH was bigger than the wild type fish.Figure 1 Establishment of the transgenic line Tg(ubi: GH)

2.2 斑馬魚尾鰭再生過程

將成年斑馬魚分為野生型對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因組，麻醉后于顯微鏡下將尾鰭橫切約80%后，連續(xù)觀察尾鰭再生情況(圖2)，在15 ～ 18 d后能夠觀察到完整的尾鰭再生。

2.3 GH促進(jìn)斑馬魚尾鰭再生過程

對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因系Tg(ubi:GH) 的斑馬魚尾鰭再生過程進(jìn)行連續(xù)拍照記錄尾鰭，測(cè)量斑馬魚尾鰭再生長(zhǎng)度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖3A)。結(jié)果顯示：與野生型斑馬魚相比，過表達(dá)GH的斑馬魚在相同時(shí)間點(diǎn)尾鰭再生的長(zhǎng)度明顯增加(圖3B-D)。為進(jìn)一步評(píng)估過表達(dá)GH對(duì)斑馬魚尾鰭再生的影響程度，分別測(cè)量橫切后8 d和18 d的尾鰭再生長(zhǎng)度，進(jìn)行t-test分析。結(jié)果顯示：與野生型斑馬魚相比，GH過表達(dá)的斑馬魚在8 dpa(圖3E)和18 dpa(圖3F)再生尾鰭的長(zhǎng)度具有顯著性差異，說明過表達(dá)GH在斑馬魚尾鰭再生過程中表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)再生作用。

注：野生型和轉(zhuǎn)基因斑馬魚尾鰭橫切后再生過程。紅色虛線標(biāo)記為橫切位置。圖2 成年斑馬魚尾鰭再生過程N(yùn)ote. The red dashed line is marked as the cross-cutting site.Figure 2 Regeneration process of adult wild-type and transgenic zebrafish caudal fins after amputation

注：A.成年斑馬魚尾鰭橫切示意圖；B-D. 不同時(shí)間點(diǎn)斑馬魚尾鰭背側(cè)、中部、腹側(cè)部位再生長(zhǎng)度；E. 橫切手術(shù)后8 d，斑馬魚尾鰭再生長(zhǎng)度t-test分析；F. 橫切手術(shù)后18 d。斑馬魚尾鰭再生長(zhǎng)度t-test分析，n4，*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.001。圖3 GH促進(jìn)斑馬魚尾鰭再生Note. A. Schematic representation of an adult zebrafish caudal fin amputation. B-D. Regenerative length of dorsal, medial and ventral parts of the caudal fin at different time points. E. t-test analysis of zebrafish caudal fin regeneration length at 8 days after amputation. F. t-test analysis of the caudal fin regeneration length at 18 days after amputation, n 4,*P < 0.05,**P < 0.001,***P< 0.001.Figure 3 Growth hormone promoted the regeneration of zebrafish caudal fin

3 討論

哺乳動(dòng)物再生能力非常有限，在組織再生研究過程中，仍存在著亟待解決的關(guān)鍵性問題：決定再生能力的因素、再生的起始因子、再生過程中細(xì)胞的去分化與轉(zhuǎn)分化、以及再生過程中細(xì)胞增殖和分布模式的控制機(jī)制等[10]。因此，充分理解再生的調(diào)控機(jī)制有助于推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。近年來，斑馬魚作為脊椎動(dòng)物再生研究模型，組織再生能力強(qiáng)，在多方面優(yōu)于果蠅、小鼠等其他模式生物[21]，例如成年斑馬魚尾鰭結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于手術(shù)、快速再生，越來越多的受到人們關(guān)注[21-23]。多種遺傳操作技術(shù)在斑馬魚上的也得到了廣泛應(yīng)用，包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)，使其作為再生研究的模型更加強(qiáng)大。

研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚鰭再生大致可以分為五個(gè)階段：再生上皮形成、間充質(zhì)解體(mesenchymal disorganization)、再生原基形成(blastema formation)、組織生長(zhǎng)和終止。再生原基的形成是關(guān)鍵性步驟，多個(gè)信號(hào)通路參與調(diào)控再生過程。如fgf20a被報(bào)道是鰭再生早期階段的一個(gè)關(guān)鍵基因[24]，能夠啟動(dòng)鰭再生過程。Geoffrey等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在鰭再生開始階段，fgf20a在上皮-間充質(zhì)邊界(epithelial-mesenchymal boundary)表達(dá)，而在Y148S突變的fgf20a突變體中，出現(xiàn)再生原基形成缺陷的表型(即Dob，devoid of blastema mutant)，阻礙鰭再生。 此外，如Lepb最近被報(bào)道為增強(qiáng)調(diào)節(jié)原件來激活組織再生[25]；Jak1/Stat3信號(hào)通路的靶基因Socs3b與再生過程中細(xì)胞免疫、免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[26]；Wnt作為Fgf信號(hào)的上游調(diào)控斑馬魚鰭再生[24, 27]；視黃酸、Bmp和Hedgehog信號(hào)也被認(rèn)為在鰭再生中發(fā)揮重要作用[11]。組織再生過程涉及細(xì)胞的增殖和分裂，GH被報(bào)道通過參與調(diào)控MAPK/ERK通路、JAK/SATA/IGF-1通路等，促進(jìn)組織再生過程中細(xì)胞增殖和分裂[27-28]。

生長(zhǎng)激素在個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用，可以通過作用于肝細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)激素受體，產(chǎn)生生長(zhǎng)介素從而促進(jìn)全身組織細(xì)胞的發(fā)育、增殖。研究表明，生長(zhǎng)激素具有明顯的促進(jìn)肝細(xì)胞再生的功能[28], 正常小鼠部分肝臟切除后，外源性GH能夠增加肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF(hepatocyte growth factor)基因的表達(dá)，加速肝細(xì)胞DNA合成反應(yīng)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的再生[29-30]。我們建立了過表達(dá)GH的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，通過尾鰭再生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：GH過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)斑馬魚尾鰭再生過程。因此，生長(zhǎng)激素具有治療肢體創(chuàng)傷的潛在活性，但其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。