劉 麗,戴曉莉，孫 超，馬玉奎*

(1. 山東仙河藥業(yè)有限公司，山東 東營 2572311； 2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價中心， 濟(jì)南 250100)

腸胃寧膠囊是由黨參、白術(shù)、黃芪、赤石脂、干姜(炭)、木香、砂仁、補(bǔ)骨脂、葛根、防風(fēng)、白芍、延胡索、當(dāng)歸、兒茶、罌粟殼、甘草(炙)等組成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾益腎、溫中止痛及澀腸止瀉的功效。該制劑主要用于脾腎陽虛所致的泄瀉，癥見大便不調(diào)、五更泄瀉、時帶黏液、伴腹脹腹痛、胃脘不舒和小腹墜脹等[1-2]。近年來，隨著中藥在臨床上的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)事件頻發(fā)，中藥的安全性越來越受到重視，但因其成分復(fù)雜，給不良反應(yīng)的監(jiān)控帶來了諸多困難[3]。故需要反過來從基礎(chǔ)研究入手，進(jìn)一步研究中藥的安全性。因腸胃寧膠囊上市前未開展毒理學(xué)評價研究，國內(nèi)無相關(guān)臨床前安全性信息，為保證臨床用藥的安全性，指導(dǎo)臨床合理用藥，保障適用人群的用藥安全，故對腸胃寧膠囊的臨床前安全性重新評價。本文在GLP條件下，利用SPF級小鼠、大鼠為實驗動物，經(jīng)單次和重復(fù)給藥，對其進(jìn)行了臨床前安全性評價研究，為該藥品的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠40只，體重(20±2)g，SPF級SD大鼠120只，體重(210±10)g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。實驗動物飼養(yǎng)于山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價中心SPF級動物房[SYXK(魯)2014-0008]，環(huán)境溫度20℃～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)每小時8～10次，動物自由飲食飲水。本實驗遵循實驗動物使用的3R原則，對動物給予人道主義關(guān)懷[IACUC審批編號：IACUC-059]。

1.2 主要試劑與儀器

腸胃寧膠囊(山東仙河藥業(yè)有限公司，批號：80930D4)。戊巴比妥鈉(德國默克公司，批號：170108)；生化分析儀所用試劑盒(上海執(zhí)誠生物技術(shù)有限公司)；生化分析儀、血液分析儀所用質(zhì)控液(英國RANDOX實驗室有限公司)；電解質(zhì)分析所用試劑、質(zhì)控液(日立儀器(蘇州)有限公司)；凝血酶原時間、凝血酶時間試劑(上海太陽生物技術(shù)有限公司)；凝血質(zhì)控血漿(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH公司)；血液分析儀所用試劑(Sysmex Corporation公司)。

SYSMEX XT-2000IV全自動血球計數(shù)儀(日本Sysmex公司)、日立7180全自動生化分析儀(日本株式會社日立高新技術(shù))、JY2001型電子天平(奧豪斯儀器常州有限公司)、TDL-5臺式低速大容量離心機(jī)(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；NP-B型生物組織包埋機(jī)(湖北諾普醫(yī)療器械有限公司)；TK-218攤烤片機(jī)(湖北泰維醫(yī)療器械有限公司)；櫻花VIP-6型生物組織脫水機(jī)(日本櫻花公司)；RM2235切片機(jī)、DMLS2顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠單次給藥毒性試驗

(一)劑量設(shè)計依據(jù)

根據(jù)藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則確定試驗劑量[4]。腸胃寧膠囊臨床用藥劑量為一日3次，一次4～5粒，每粒0.3 g，故人用日最大劑量為4.5 g，按照成人體重為60 kg計算，為0.075 g/ kg。按照等效劑量折算系數(shù)計算小鼠等效劑量約為0.7 g/kg。

腸胃寧膠囊內(nèi)容物最大溶解度為0.4 g/mL，小鼠最大灌胃體積為40 mL/kg，故可采用最大給藥濃度和最大給藥體積給予小鼠，即單次給藥16 g/kg，一日給藥2次，總劑量為32 g/kg。

(二)實驗方法

SPF小鼠40只，給藥前禁食約12 h，空腹后按體重均衡原則分為2組，即空白對照組和腸胃寧膠囊組。腸胃寧膠囊組按照40 mL/kg給藥容積灌胃給予0.4 g/mL濃度的藥物混懸液，給藥2次，間隔約6 h，空白對照組給予等容積的純水。給藥后詳細(xì)觀察動物的外觀反應(yīng)，分別于藥后3、7、10、14 d稱量動物體重，每天觀察1次，連續(xù)觀察14 d。觀察結(jié)束，戊巴比妥鈉安樂處死小鼠后剖檢，肉眼觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等主要臟器有無分泌物(或滲出物)、淤血、出血、水腫、壞死等肉眼可見病變，如有病變組織需進(jìn)行毒性病理學(xué)檢查。

1.3.2 大鼠重復(fù)給藥毒性試驗

(一)劑量設(shè)計依據(jù)

根據(jù)藥物臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則確定試驗劑量[4]。腸胃寧膠囊臨床用藥劑量為一日3次，一次4～5粒，每粒0.3 g，故人用日最大劑量為4.5 g，按照成人體重為60 kg計算，為0.075 g/kg。按照等效劑量折算系數(shù)計算大鼠的等效劑量約為0.5 g/kg。重復(fù)給藥毒性試驗?zāi)康臑楸M可能暴露藥物的毒性，故考慮到本品毒性較小及給藥可操作性，高劑量可采用0.3 g/mL給藥濃度和15 mL/kg給藥容積，一日2次灌胃給藥。選用高劑量的1/3和1/9作為則中、低劑量，三個劑量分別為9、3、1 g/kg，分別相當(dāng)于藥效學(xué)劑量的18、6和2倍，臨床人用劑量的120、40和13倍。

(二)實驗方法

SPF大鼠120只，按體重均衡原則[5-6]分為4組，即空白對照組和腸胃寧膠囊9、3、1 g/kg三個劑量組，每組30只動物，雌雄各半。各組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物混懸液15 mL/kg，空白對照組給予等容積的純水。大鼠上下午各給藥1次，間隔約6 h，連續(xù)給藥13周，停藥恢復(fù)4周。每次給藥前后詳細(xì)觀察動物的外觀反應(yīng)，每周稱量1次體重和攝食量。給藥13周結(jié)束各組取20只大鼠，恢復(fù)4周結(jié)束各組取剩余10只大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血，進(jìn)行血液學(xué)及血液生化學(xué)檢查。剖檢摘取各臟器，其中心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢、腎上腺、胸腺主要臟器需稱量。所有臟器中性甲醛溶液固定后進(jìn)行毒性病理學(xué)檢查。

1.3.3 檢測指標(biāo)

血液學(xué)指標(biāo)：白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白 (HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、中性細(xì)胞比率(NEUT%)、淋巴細(xì)胞比率(LYMPH%)、嗜酸性粒細(xì)胞比率(EO%)、嗜堿性粒細(xì)胞比率(BASO%)、單核細(xì)胞比率(MONO%)、紅細(xì)胞分布寬度-變異系數(shù)(RDW-CV)、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率 (RET%)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。

血液生化學(xué)指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)、肌酐(CR)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、肌酸激酶(CK)、鈉離子(Na+)、鉀離子(K+)、氯離子(Cl-)。

病理檢查器官或組織：腦、心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、甲狀腺、胸骨、脊髓(頸、胸、腰段)、甲狀旁腺、食管、氣管、頜下腺、胃、小腸、大腸、直腸、胰腺、主動脈、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)、膀胱、前列腺、垂體。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠單次給藥毒性試驗

小鼠灌胃給予腸胃寧膠囊后當(dāng)日及連續(xù)觀察14 d內(nèi)未見明顯毒性反應(yīng)，腸胃寧膠囊各劑量組動物體重增長與同期空白對照組基本一致。觀察期結(jié)束后剖檢小鼠，各主要臟器色澤、形態(tài)均正常，觸及無結(jié)節(jié)，均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見異常，故未進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。故本試驗條件下，小鼠最大給藥量為32 g/kg。小鼠體重數(shù)據(jù)見下表1。

2.2 大鼠重復(fù)給藥毒性試

試驗結(jié)果顯示，所有動物均未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)。大鼠連續(xù)灌胃給藥13周及恢復(fù)4周檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，腸胃寧膠囊9、3、1 g/kg三個劑量組大鼠體重、攝食量、血液學(xué)、血液生化學(xué)及臟器相對重量均無明顯差異(P>0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，所有大鼠所有臟器均未出現(xiàn)藥物相關(guān)性病理組織學(xué)病變。給藥13周大鼠主要檢測指標(biāo)見表2和表3，肝、腎病理圖片見圖1。

表1 腸胃寧膠囊對小鼠體重的影響

表2 腸胃寧膠囊重復(fù)給藥13周對SD大鼠血液學(xué)的影響

表3 腸胃寧膠囊重復(fù)給藥13周對SD大鼠血液生化學(xué)的影響

注：A：腸胃寧膠囊高劑量組-肝；B：空白對照組-肝；C：腸胃寧膠囊高劑量組-腎；D空白對照組-腎。圖1 給藥13周時小鼠腸胃寧膠囊高劑量組及空白對照組組織病理學(xué)圖片(×10，HE染色)Note. A，High dosage of Chang Wei Ning capsule group，liver. B，Normal control group，liver. C，High dosage of Chang Wei Ning capsule group，kidney.D，Normal control group，kidney.Figure 1 Histopathological images of Chang Wei Ning capsule and normal control mice during 13week administration(HE staining)

3 討論

單次給藥毒性(急性毒性，single dose toxicity)是指一天內(nèi)一次或者多次將受試藥物給予動物后產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。其目的是初步探索藥物的毒性作用和毒性靶器官。臨床上藥物過量導(dǎo)致的急性中毒相關(guān)信息可從此試驗研究結(jié)果中獲得。單次給藥毒性試驗研究常用LD50法、最大耐受量、最大給藥量、限度試驗等方法[6]。對于毒性較小的藥物，最常用的方法為最大給藥量法，是指動物單次或24 h內(nèi)多次(2～3次)給藥所采用的最大給藥劑量。腸胃寧膠囊內(nèi)容物最大溶解度為0.4 g/mL，小鼠最大灌胃體積為40 mL/kg，故可給予小鼠的最大給藥量為16 g/kg，一日可給藥2次。本試驗結(jié)果顯示，本品在日最大給藥量(MFD)32 g/kg時小鼠未見任何不良反應(yīng)，相當(dāng)于小鼠藥效學(xué)等效劑量的46倍左右，臨床人用劑量的427倍左右。

重復(fù)給藥毒性試驗研究(repeated dose toxicity)是藥物臨床前安全性評價最主要內(nèi)容，通過將藥物按照臨床用藥途徑大劑量重復(fù)多次給予動物，密切檢測動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和中毒靶組織器官，能夠獲得毒性產(chǎn)生的量效和時效關(guān)系，預(yù)測藥物在臨床上可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)性質(zhì)及發(fā)生率，對藥物的臨床應(yīng)用具有重要的參考意義[4,7]。本文SD大鼠重復(fù)給藥毒性試驗結(jié)果表明，腸胃寧膠囊9、3、1 g/kg三個劑量下對大鼠體重、攝食量、血液學(xué)、血液生化學(xué)及臟器相對重量均無明顯影響。病理學(xué)檢查結(jié)果亦顯示，以上劑量下未見明顯的毒性靶器官。從試驗結(jié)果可得大鼠重復(fù)給藥13周最大無毒反應(yīng)劑量(NOAEL)大于9 g/kg，此劑量相當(dāng)于大鼠藥效學(xué)等效劑量的18倍，臨床人用劑量的120倍。

綜上所述，通過本研究結(jié)果可得腸胃寧膠囊小鼠單次給藥最大給藥量(MFD)為32 g/kg；大鼠重復(fù)給藥13周最大無毒反應(yīng)劑量(NOAEL)大于9 g/kg。提示本品臨床應(yīng)用安全范圍較大，安全窗較寬。