閆文卓，周 潔，胡建華，劉鐵龍，張圓圓,趙麗麗, 陳洪巖*，陸濤峰*

(1.黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 100193；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；3.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 濟(jì)源 454650)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新資源開(kāi)發(fā)與利用，一直是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技工作者的長(zhǎng)期堅(jiān)持的任務(wù)[1]。實(shí)驗(yàn)貓常被用于腦神經(jīng)的生理及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)，也是藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物疾病模型中常用的動(dòng)物[2]，但是由于在飼料、飼養(yǎng)、繁殖和疫病凈化等方面存在難題，貓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)展緩慢[3]。國(guó)外很多國(guó)家已經(jīng)建立了實(shí)驗(yàn)貓的繁育基地，有的國(guó)家通過(guò)疫病凈化已培育出SPF貓和無(wú)菌貓，而我國(guó)目前尚無(wú)權(quán)威的貓保種和繁育基地，多數(shù)用于實(shí)驗(yàn)的貓多來(lái)自于寵物貓或捕獲的野貓，安全隱患突顯。

貓細(xì)小病毒(feline panleukopenia virus, FPV)又稱貓泛白細(xì)胞減少綜合征病毒、貓傳染性腸炎病毒或貓瘟病毒，主要感染貓科和鼬科等多種動(dòng)物，是目前肉食動(dòng)物細(xì)小病毒屬中感染范圍最廣、致病性最強(qiáng)的一種病毒[4]，能引起以高熱、嘔吐、腸炎和白細(xì)胞嚴(yán)重減少為特征的急性、高度接觸性傳染病，死亡率一般為50%～60%。該病在世界范圍內(nèi)存在，我國(guó)多地均有本病發(fā)生，對(duì)貓及其它貓科動(dòng)物危害極大[5-7]。針對(duì)該病免疫，有多種商品化疫苗(荷蘭英特威、美國(guó)輝瑞和法國(guó)維克等)可以選擇，但是針對(duì)該病的診斷試劑卻參差不齊，因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、特異和靈敏的診斷方法不僅對(duì)于貓群體疫病凈化有重要意義，更有利于推動(dòng)我國(guó)實(shí)驗(yàn)貓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

貓細(xì)小病毒(feline panleukopenia virus, FPV)由吉林大學(xué)任文陟老師惠贈(zèng)。F81細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。山羊抗貓IgG-HRP購(gòu)自Abcam公司。商品化FPV抗體ELISA試劑盒，貓皰疹病毒1型(FHV-1)和貓杯狀病毒(FCV)陰、陽(yáng)性對(duì)照血清均購(gòu)自荷蘭的BV European Veterinary Laboratory(EVL)公司。75份貓血清采自上海、大連和黑龍江等地。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循3R原則及動(dòng)物福利倫理相關(guān)要求。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀使用美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱使用Heal force公司產(chǎn)品，超速離心機(jī)使用Beckman公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病毒滴度(TCID50)測(cè)定

將獲得的病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-8，共8個(gè)梯度)接種到F81細(xì)胞，每個(gè)梯度8個(gè)重復(fù)，72 h后觀察細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench法[8]計(jì)算病毒滴度。

1.3.2 抗原制備及濃縮純化

培養(yǎng)F81細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合，按照感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection)為1的比例接種FPV病毒，待培養(yǎng)72 h后收集病毒液，反復(fù)凍融3次。收集的病毒液利用超速離心法濃縮純化抗原。首先將病毒液4℃，4000 r/min離心20 min去除細(xì)胞碎片，收集上清，再重復(fù)一次；再將收集的上清使用32 Ti超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子，28 000 r/min于4℃離心2 h濃縮病毒；最后沉淀用500 μL PBS重懸，充分混勻，并用紫外分光光度法測(cè)定抗原蛋白含量。

1.3.3 最佳工作濃度的確定

以制備的抗原為包被抗原，用碳酸鹽緩沖液倍比稀釋為40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL和0 μg/mL包被酶標(biāo)板，以1∶100倍稀釋的FPV陽(yáng)性血清為待檢血清，將酶標(biāo)抗體(山羊抗貓IgG-HRP)分別以1∶6000，1∶8000，1∶10000，1∶16000稀釋，采用方陣法確定抗原和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度。

以5 μg/mL的抗原濃度包被酶標(biāo)板，優(yōu)化封閉液和封閉時(shí)間。封閉液主要選擇5%脫脂奶粉、5%胎牛血清和5% BSA，封閉時(shí)間選擇37℃ 1 h、37℃ 2 h和4℃過(guò)夜。

1.3.4 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

1.3.5 特異性試驗(yàn)

以優(yōu)化的最佳檢測(cè)條件，用制備的抗原包被酶標(biāo)板，將FPV、FHV-1和FCV的陽(yáng)性對(duì)照血清進(jìn)行1∶100倍稀釋進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.3.6 敏感性試驗(yàn)

先將FPV陽(yáng)性血清做50倍稀釋，然后進(jìn)行2倍梯度倍比稀釋(1∶100～1∶6400)，用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，將最大稀釋比例為陽(yáng)性的稀釋度判定為該方法的靈敏度。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

為了測(cè)定批內(nèi)重復(fù)性，隨機(jī)選擇5份貓血清樣品，使用同一批包被的酶標(biāo)板重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)。為了測(cè)定批間重復(fù)性，隨機(jī)選擇5份貓血清樣品，使用不同批次包被的酶標(biāo)板重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算批間變異系數(shù)(CV)。

1.3.8 初步應(yīng)用及比較研究

用建立的ELISA方法和EVL試劑盒同時(shí)檢測(cè)收集的75份貓血清，通過(guò)比較判定該方法的符合率。符合率=(陽(yáng)性樣品數(shù)+陰性樣品數(shù))/樣品總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度的確定

采用Reed-Muench法，測(cè)定獲得FPV的滴度為5.76 lgTCID50/0.1 mL。

2.2 最佳工作條件的確定

通過(guò)方陣法，最終確定的抗原和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度分別為5 μg/mL和1∶6000。通過(guò)優(yōu)化封閉液發(fā)現(xiàn)5%脫脂奶粉具有良好的封閉效果，封閉時(shí)間三組之間差異不顯著，鑒于37℃1 h能節(jié)省時(shí)間，因此選擇5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h為最佳封閉條件。

2.3 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

以優(yōu)化的最佳檢測(cè)條件，檢測(cè)FPV、FHV-1和FCV的陽(yáng)性對(duì)照血清，結(jié)果顯示只有FPV陽(yáng)性血清的觀測(cè)值大于0.401，判定為陽(yáng)性，而FHV-1和FCV陽(yáng)性血清的觀測(cè)值均低于0.401，判定為均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

利用建立的抗體ELISA方法，分別對(duì)EVL試劑盒陽(yáng)性對(duì)照和臨床陽(yáng)性血清進(jìn)行梯度稀釋，以測(cè)定該方法的敏感性。結(jié)果如圖2所示，EVL試劑盒陽(yáng)性對(duì)照在稀釋度大于1∶800時(shí)觀測(cè)值低于0.401，而臨床陽(yáng)性血清在稀釋度大于1∶5000是觀測(cè)值低于0.401，表明建立的抗體ELISA方法檢測(cè)臨床陽(yáng)性血清的敏感性為1∶5000。另外，在實(shí)驗(yàn)中研究人員發(fā)現(xiàn)EVL的試劑盒陽(yáng)性對(duì)照的OD450值相對(duì)于臨床血清測(cè)得的OD450值偏低，說(shuō)明利用本方法檢測(cè)臨床樣品的敏感性良好。

注：圖中紅色橫線表示Cut-off值。圖1 特異性實(shí)驗(yàn)Note. The red line in the figure represents the cut-off value.Figure 1 Specificity experiment

注：圖中紅色橫線表示Cut-off值。圖2 敏感性實(shí)驗(yàn)Note. The red line in the figure represents the cut-off value.Figure 2 Sensitivity experiment

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別采用同批次和不同批次包被的酶標(biāo)板，分別檢測(cè)5份貓血清樣品，每份樣品重復(fù)3次，結(jié)果如表1所示，批次內(nèi)和批次間的變異系數(shù)分別為8.68%和7.14%，除2份陰性血清的變異系數(shù)稍大外(12%和13.9%)，陽(yáng)性血清在批次間和批次內(nèi)的重復(fù)性均良好(<10%)。分析原因，陰性樣品測(cè)定變異系數(shù)偏大可能是儀器測(cè)定誤差所導(dǎo)致的。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的ELISA方法和EVL試劑盒檢測(cè)收集的75份貓血清，陰陽(yáng)性判定結(jié)果如表2所示，計(jì)算符合率為90.7%(68/75)。因此建立的FPV抗體檢測(cè)方法與EVL公司試劑盒的符合率為90.7%。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表2 臨床樣品檢測(cè)

3 討論

貓是藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物疾病模型中常用的動(dòng)物，中國(guó)藥典也規(guī)定了貓作為降壓藥檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于缺乏檢測(cè)試劑，多數(shù)用于實(shí)驗(yàn)的貓多為未經(jīng)檢測(cè)的寵物貓或捕獲的野貓，安全隱患突顯。為了推動(dòng)我國(guó)實(shí)驗(yàn)貓質(zhì)量改善，提高實(shí)驗(yàn)貓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化水平，本團(tuán)隊(duì)一直致力于實(shí)驗(yàn)貓?jiān)\斷制劑的開(kāi)發(fā)。FPV是侵害貓的重要病原微生物，該病的發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響貓的健康。雖然已有多種針對(duì)貓細(xì)小病毒的疫苗可以用于該病的防控，但該病的抗體檢測(cè)試劑盒一直沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商品化，嚴(yán)重制約實(shí)驗(yàn)貓的質(zhì)量提高。雖然早在1990年就有貓細(xì)小病毒間接ELISA方法的報(bào)道[9]，也有多篇文獻(xiàn)[10-13]報(bào)道了FPV抗體檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用，但一直沒(méi)有可以真正應(yīng)用于臨床檢測(cè)的產(chǎn)品出現(xiàn)，也缺乏FPV的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施。因此，本研究致力于建立一種FPV抗體檢測(cè)方法，并應(yīng)用于進(jìn)一步試劑盒的開(kāi)發(fā)。

為了提高檢測(cè)方法的敏感性，本研究利用純化的FPV作為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化抗原濃度、封閉液、封閉時(shí)間、待檢血清稀釋度和酶標(biāo)抗體的濃度，建立了特異性、敏感性、穩(wěn)定性良好的FPV抗體檢測(cè)方法。該方法批次內(nèi)和批次間的變異系數(shù)分別為8.68%和7.14%，檢測(cè)臨床血清的靈敏度大于1∶5000，與國(guó)外試劑盒符合率達(dá)到90.7%。值得提到的是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員比較了國(guó)內(nèi)某品牌試劑盒和國(guó)外試劑盒與該方法的差異，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)的某個(gè)檢測(cè)產(chǎn)品完全不能工作，國(guó)外試劑盒雖然與本方法符合率較好，但其陽(yáng)性對(duì)照一直不穩(wěn)定，也存在一定缺陷。此外，利用該方法檢測(cè)臨床貓血清樣品發(fā)現(xiàn)血清陽(yáng)性率達(dá)84%(63/75)，高于其他研究的73%(44/60)，由于大部分貓的來(lái)源、疫苗免疫狀況等不甚清楚，所以無(wú)法確定抗體陽(yáng)性個(gè)體是接種疫苗產(chǎn)生抗體，還是自然感染產(chǎn)生的抗體，但也從一定程度反映了FPV感染的風(fēng)險(xiǎn)。由于貓陰性血清的不易得，因此在本方法的Cut-off值判定中僅選擇了12個(gè)陰性樣品，這種狀況也反映了貓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的重要性。

綜上，本研究建立了貓F(tuán)PV抗體ELISA檢測(cè)方法，該方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性良好，而且操作簡(jiǎn)便、快速，從而為貓F(tuán)PV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。