黃海燕，李福記，林 鵬，廖蘊(yùn)華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，隨著人口老齡化以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，慢性腎病發(fā)病率逐年上升。據(jù)調(diào)查，我國18歲以上成年人群中的CKD的患病率為10.8%[1]。終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是各種腎疾病的最終發(fā)展趨勢(shì)。而死于慢性腎病及其并發(fā)癥的病例越來越多。流行病學(xué)報(bào)道，至2016年，全球每年有超過2100萬起CKD事件，2.76億起流行病例，近120萬起病例死于CKD，3500萬起因CKD喪失健康生活[2]。目前慢性腎病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，發(fā)病后對(duì)機(jī)體的影響研究仍需要不斷的進(jìn)行。人體的研究常受到諸多不可控因素的影響。所以，慢性腎功能衰竭的動(dòng)物模型成為研究慢性腎病的重要補(bǔ)充。目前制作慢性腎衰竭的方法有物理方法和化學(xué)方法。其中物理方法中腎大部分切除由于更接近臨床實(shí)際、簡便易行、穩(wěn)定性重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被人們廣泛應(yīng)用[3]。在腎大部分切除模型中，迅速而有效的止血又是模型成功的關(guān)鍵。目前的止血方法有縫合止血法、電凝止血法、生物膠止血法、止血藥物止血、壓迫止血。腎屬于深部器官，壓迫止血難以達(dá)到效果。同時(shí)它是血運(yùn)豐富、脆性大的實(shí)質(zhì)性器官，縫合止血極易產(chǎn)生針眼、組織切割破損，造成針眼出血或裂口出血等不良反應(yīng)，對(duì)于動(dòng)物模型腎止血困難、術(shù)后并發(fā)癥多，所以縫合止血成功率低[4-5]。生物膠和電凝止血法相對(duì)于其他止血方法，手術(shù)成功率高，止血效果確切。本研究旨在比較3M組織膠止血和電凝止血在建立慢性腎疾病中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠80只，體重(200±20)g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(桂)2014-0002] [SYXK(桂)2014-0003]。飼養(yǎng)條件：溫度25℃，濕度40%～60%，晝夜循環(huán)各12 h，標(biāo)準(zhǔn)高壓消毒飼料，不限制進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)相關(guān)要求(福利倫理審查號(hào)201702002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

3M組織膠購買于 Minnesota Mining and Manufacturing(USA)，型號(hào)1469SB，規(guī)格3 mL液體。異氟烷購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。氣體麻醉機(jī)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 尿毒癥模型的建立

動(dòng)物隨按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，A組：3M組織膠止血(n=40)，B組：電凝止血(n=40)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)。采用5/6腎切除制作尿毒癥大鼠模型。A組：異氟烷氣體麻醉成功后，右側(cè)臥位，常規(guī)備皮，消毒、鋪巾。在左側(cè)肋下1 cm、脊柱肌肉往腹部方向旁開0.5 cm行約1 cm的縱行切口，依次打開皮下組織、肌肉層，暴露左側(cè)腎，分離腎組織，剝離腎包膜，止血夾夾住腎蒂阻斷血流，按雙腎體重占大鼠體重的0.74%，切除腎上下極各1/3并稱重，用3M組織膠水2～3滴(約0.1～0.15 mL)滴于切口，數(shù)秒后膠水自然風(fēng)干，觀察上下兩極切口均無出血后逐層縫合傷口，術(shù)后肌肉注射青霉素鈉40萬單位。B組：按上述同樣的方法暴露左腎并切除左腎上下極各1/3并稱重，切面使用電凝徹底止血，觀察無出血后逐層縫合傷口。所有大鼠左腎2/3切除后一周，同樣的方法切除右腎，術(shù)后肌肉注射青霉素鈉40萬單位。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

分別記錄兩組實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)際左腎切除的出血量、左腎蒂阻斷血流的時(shí)間。同時(shí)記錄1周、2周、3周、4周的死亡數(shù)。觀察各鼠手術(shù)后精神狀態(tài)、食量、毛色等一般情況。分別采用內(nèi)眥采血法采取各大鼠術(shù)前、術(shù)后1月的血檢測(cè)血尿素氮、肌酐。收取大鼠24 h尿并檢測(cè)24 h尿蛋白定量。

1.3.3 標(biāo)本采集及處理

采血后以3000 r/min離心分離血清。送本院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清肌酐、尿素氮。同時(shí)測(cè)定24 h尿蛋白定量。在二次手術(shù)后6月兩組大鼠各取5只處死，左側(cè)殘腎用 4%中性甲醛緩沖液浸泡后，石蠟包埋切片，行HE染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建情況

兩組大鼠手術(shù)前內(nèi)眥靜脈血測(cè)肌酐及尿素氮，作為正常值。在二次腎切除術(shù)后1月和8月再次內(nèi)眥采血測(cè)血肌酐及尿素氮，二者達(dá)到術(shù)前2～3倍為造模成功[6-7]。術(shù)后各存活鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，食量下降，弓背蜷縮，活動(dòng)量下降，毛色干枯、疏松不齊、無光澤。

2.2 兩組大鼠術(shù)后存活率

A組和B組術(shù)后1周內(nèi)大鼠存活數(shù)量分別是38只和32只，存活率分別為95%(38/40)和80%(32/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后2周內(nèi)存活數(shù)量分別是38只和30只，存活率分別是95%(38/40)和75%(30/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3周內(nèi)存活數(shù)量分別是38只和27只，存活率分別是95%(38/40)和67.5%(27/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四周內(nèi)存活數(shù)量分別是38只和27只，存活率分別是95%(38/40)和67.5%(27/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 左腎阻斷血流時(shí)間以及出血量的評(píng)估

左腎阻斷血流時(shí)間以及出血量的評(píng)估見表1，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 腎功能檢測(cè)指標(biāo)

兩種手術(shù)止血方法術(shù)后血清尿毒氮及肌酐水平。見表2，根據(jù)Zareie等[7]報(bào)告結(jié)果為正常大鼠的2～3倍為造模成功，本研究兩種止血方法的大鼠尿毒癥模型制作均成功。

2.5 腎組織病理學(xué)改變

兩種手術(shù)止血方法大鼠殘余腎腎小球缺血皺縮，球囊粘連，部分腎小球代償性增加，結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管內(nèi)可見蛋白管型，小管間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.6 尿蛋白定量

術(shù)前24 h尿蛋白定量(10.66±4.26)mg/24 h，術(shù)后測(cè)24 h尿蛋白定量(83.90±109.78)mg/24 h。

3 討論

本研究表明，兩種止血方法均成功制作慢性腎衰竭大鼠尿毒癥模型。3M組織膠在制造慢性腎衰竭動(dòng)物模型腎切除術(shù)中，術(shù)后存活率高于電凝止血。腎蒂血流阻斷時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量均低于電凝止血。

3M組織膠水是一種氰基丙烯酸正丁酯粘合劑，具有聚合熱低、粘接強(qiáng)度高、生物組織相容性和擴(kuò)散性能好，在水或血液中的陰離子作用下迅速固化成和人體組織韌性相近的生物薄膜等優(yōu)良特點(diǎn)[8-9]，具備在聚合過程中抑制細(xì)胞生長、低炎癥反應(yīng)、可以降解的特性[10-11]。該類型粘合劑在人體中有報(bào)道研究主要應(yīng)用在皮膚等表淺部位的粘合，也有用于頭頸部手術(shù)的粘合。其在皮膚縫合中的效果以及安全性與縫線縫合的相當(dāng)，但是手術(shù)時(shí)間卻明顯縮短，這與本研究觀察到的現(xiàn)象一致[12]。

表1 左腎血流阻斷時(shí)間和出血量

注: 與3M組織膠組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the 3M vetbond tissue adhesive group，*P<0.05.

表2 兩組血肌酐及尿素氮對(duì)比

注：術(shù)后兩組血肌酐及尿素氮均升高，達(dá)到大鼠尿毒癥模型標(biāo)準(zhǔn)。

Note. The serum creatinine and urea nitrogen of the two groups were increased postoperation, which reached the standard of animal uremia model.

注： A為3M組織膠組，B為電凝組。兩組均可見腎小球缺血皺縮，小管間質(zhì)纖維化，有炎細(xì)胞浸潤。圖1 腎組織病理學(xué)改變(HE染色，×100,×400)Note. A is for the 3M vetbond tissue adhesive group and B is for the electrocoagulation group. In both groups, glomerular ischemic shrinkage, tubular interstitial fibrosis, and inflammatory cell infiltration were observed.Figure 1 Pathological changes of the kidneys(HE staining)

電凝是利用高頻電流對(duì)組織產(chǎn)生熱效應(yīng)，使受熱組織局部溫度升高，致使組織細(xì)胞變性、壞死、干燥、氣化、碳化，達(dá)到止血和分離作用[13]。其利用高頻高壓電弧切割并電凝止血,對(duì)生物組織熱損傷十分嚴(yán)重[14]。

本研究中，從血清肌酐、尿素氮以及腎病理結(jié)果表明兩種止血方法制作大鼠5/6腎切除尿毒癥模型均成立。組織膠止血和電凝止血均是目前主流的止血方式，本研究表明組織膠止血展現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。組織膠止血組在出血量、腎血流阻斷的時(shí)間、術(shù)后死亡率均較電凝止血法低。病理結(jié)果提示3M組織膠組創(chuàng)面愈合良好，炎癥細(xì)胞浸潤少。 Espin等[15]報(bào)道組織膠和可吸收線縫合在胃大部分切開術(shù)縫合中組織病理以及炎癥指標(biāo)上無明顯差異，但是組織膠組手術(shù)時(shí)間明顯縮短。同樣，本研究結(jié)果與臨床上部分切除術(shù)的觀察結(jié)果相似[16]。Sultan[17]報(bào)道稱組織膠在顱骨手術(shù)中也同樣顯示出了操作簡易、安全、物美價(jià)廉等方面的優(yōu)點(diǎn)。報(bào)道稱含該類有效成分的生物膠在使用后6月在大鼠體內(nèi)降解[18]，研究人員在術(shù)后8月解剖大鼠時(shí)也發(fā)現(xiàn)手術(shù)切面無生物膜包裹，考慮為已降解。

相對(duì)3M組織膠止血，電凝止血存在一些缺點(diǎn)，創(chuàng)面滲血常導(dǎo)致止血困難，電灼使腎切面布滿焦痂，創(chuàng)面的滲血需要電凝刀尖反復(fù)點(diǎn)灼，這個(gè)過程又將焦痂扯開，焦痂的脫落增加新的出血?jiǎng)?chuàng)面，反復(fù)的電灼導(dǎo)致殘存腎皮質(zhì)髓質(zhì)的進(jìn)一步損傷，破壞殘存腎的血供影響實(shí)際殘存腎單位數(shù)量和功能。這可能是電凝止血組死亡率高的主要原因之一。此外，反復(fù)不斷的對(duì)傷口進(jìn)行燒灼止血，燒灼過程中不斷的刮擦電凝刀頭上的焦化組織也可能會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。而3M組織膠是一種生物制劑，有效成分氰基丙烯酸酯類，其聚合快速、熱量低、粘合性高、組織相容性好，固化成膜固化時(shí)間10 s[19]。止血時(shí)間通常被認(rèn)為是止血性能研究中最為直觀和常見的評(píng)價(jià)指標(biāo)，出血量也是反映止血效果的重要指標(biāo)[20]。本研究表明，3M組織膠無論在止血時(shí)間還是出血量上均優(yōu)于電凝止血。已經(jīng)有證據(jù)表明氰基丙烯酸酯抗菌作用，尤其對(duì)革蘭陽性菌[21-23]。組織膠組術(shù)后死亡率低，也可能是其有效成分具有抗菌作用有關(guān)系。

其次，從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看，3M組織膠每瓶3 mL，市場(chǎng)價(jià)格300元左右，且購買渠道廣泛，容易獲得，另外，使用過程中不需要配備特殊的儀器設(shè)備，一定程度上可以有效地將成本降低。而電凝止血需要專門配置相應(yīng)的電凝設(shè)施，其配套設(shè)施價(jià)格昂貴，且使用過程中電凝設(shè)備的耗損也進(jìn)一步引起成本增加，這對(duì)于經(jīng)濟(jì)條件受限的單位和個(gè)人都是不容忽視的問題。所以，3M組織膠止血對(duì)于電凝止血無論是在科學(xué)角度還是經(jīng)濟(jì)角度均占優(yōu)勢(shì)。

此研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值，目前進(jìn)行的慢性腎功能不全的實(shí)驗(yàn)研究中，如何保護(hù)腎功能、延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎功能的進(jìn)展是一個(gè)熱門話題[24]。那么成功的制作慢性腎功能不全的模型是尤為重要。而在手術(shù)切除腎制作該模型中，安全有效的止血是關(guān)鍵。本研究表明，3M組織膠的止血效果優(yōu)于電凝止血。且在經(jīng)濟(jì)學(xué)角度看來，性價(jià)比更高。