阮中繁，謝 明*，李 艷，王橋生

(1. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院麻醉科；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽 421000)

急性腦梗死(acute cerebral infarct，ACI)是指腦部供血障礙引起的腦組織壞死，具有較高的致死率和致殘率，嚴重威脅國民健康[1]。參麥注射液是由紅參和麥冬兩味中藥制備而成的復(fù)方制劑，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，其具有改善微循環(huán)，增強免疫力，增加腦血流量，降低腦組織耗氧量及清除自由基的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液對于急性腦梗死的治療具有較好的臨床療效，但其機制還尚未明確[3]。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一類抑制細胞凋亡的蛋白，鈣蛋白酶1(calcium activated papain-like cysteine protease-1, calpain-1)是一種降解各種肌肉蛋白的酶[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Bcl-2和calpain均可減輕腦缺血性損傷[6]。因此，本研究通過構(gòu)建急性腦梗死小鼠模型并給以參麥注射液干預(yù)，測定Bcl-2和calpain-1的表達來探討參麥注射液對其作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性CD-1小鼠30只，體重25～30 g，購于南華大學(xué)實驗動物中心[SCXK(湘)2015-0002]，飼養(yǎng)于南華大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK(湘)2015-0001]。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用潔凈水(均由南華大學(xué)實驗動物中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境： 12 h光照/12 h黑暗，黑暗，濕度恒定，溫度20℃～25℃。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：TSME1 2016-001)。

1.2 主要試劑與儀器

A1級MCAO線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)，參麥注射液(神威藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格10 mL×5支，國藥準(zhǔn)字Z13302088)，0.9%氯化鈉注射液(湖南科倫制藥有限公司， 500 mL，國藥準(zhǔn)字H43020454)，4%多聚甲醛(北京索萊寶生物科技有限公司)，Abgent alpain-1單克隆抗體，Bcl-2單克隆抗體(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，TRIzolTMReagent(購自賽默飛世爾科技中國有限公司)；DAB 顯色試劑盒(北京中杉生物工程有限公司)，TUNEL試劑盒(默克生命科學(xué))。半自動輪轉(zhuǎn)式切片機CUT5062(北京萊比信科技發(fā)展有限公司)，ND-2000超微量分光光度計(北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司)，光學(xué)顯微鏡(北京博恒遠科技有限公司)，超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構(gòu)建及處理

本實驗以30只成年雄性CD-1小鼠為研究對象，隨機分為對照組、模型組和實驗組，每組各10只。按照文獻法[7]構(gòu)建小鼠永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型，對照組接受假手術(shù)操作1 h后腹腔注射0.3 mL生理鹽水，每天1次；模型組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù) 1 h后腹腔注射0.3 mL生理鹽水，每天1次；實驗組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1 h腹腔注射0.3 mL參麥注射液，每天1次。三組小鼠均干預(yù)2周。

1.3.2 紅細胞免疫功能指標(biāo)的檢查

采用眼球后靜脈叢采血1 mL置于枸櫞酸鈉抗凝管中，離心取上層血漿備用，從下層取出50 μL紅細胞加450 μL 0.9%氯化鈉注射液混勻，檢測紅細胞濃度，加0.9%氯化鈉注射液稀釋至終濃度1.25×107/mL。將凍存致敏酵母菌混勻，將50 μL紅細胞液與50 μL血漿及50 μL酵母菌混勻，37℃水浴10 min，加入25 μL 0.25%戊二醛，分別取1/2的量以毛細吸管涂片，吹干，加100 μL甲醇固定后，采用瑞氏染液與緩沖液(1∶3)染色30 s，自來水沖洗3遍后，濕片鏡檢并計數(shù)(與紅細胞結(jié)合2個以上酵母菌)，得出紅細胞復(fù)合物花環(huán)形成率(red blood cell- immune complex rosette，RBC-ICR)。同法測定紅細胞表面C3b受體(RC3bR)。

1.3.3 TUNEL試劑盒檢測各組神經(jīng)元凋亡

制備腦組織石蠟切片，依據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織凋亡神經(jīng)元并拍照計數(shù)。

1.3.4 Western blot法檢測calpain-1、Bcl-2蛋白水平的影響

剪取部分腦組織提取總蛋白，調(diào)整蛋白濃度后進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜后進行封閉，清水洗膜后，Abgent calpain-1單克隆抗體或Bcl-2單克隆抗體4℃孵育12 h。洗膜后，室溫孵育熒光標(biāo)記羊抗兔抗體2 h，免疫印跡顯色后進行曝光，采用ImageJ軟件對條帶進行分析。

1.3.5 q-PCR法檢測calpain-1、Bcl-2 mRNA的表達

剪取部分腦組織，液氮研磨后嚴格按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，進行熒光定量反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組紅細胞免疫功能比較

與對照組比較，實驗組RBC-C3bR明顯降低，RBC-ICR顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，實驗組RBC-C3bR明顯增高，RBC-ICR顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組腦組織的神經(jīng)元凋亡率比較

對照組小鼠腦組織切片TUNEL陽性細胞較少，模型組和實驗組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)； 實驗組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細胞數(shù)明顯低于模型組小鼠(P<0.05)，見圖1。

2.3 各組腦組織calpain-1、Bcl-2蛋白水平比較

與對照組小鼠比較，模型組和實驗組小鼠的calpain-1蛋白顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠相比，實驗組小鼠calpain-1蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2。

2.4 各組腦組織calpain-1、Bcl-2 mRNA水平比較

與對照組小鼠比較，模型組和實驗組小鼠的calpain-1 mRNA表達水平顯著升高，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠相比，實驗組小鼠calpain-1 mRNA表達水平顯著降低，Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

表1 各組紅細胞免疫功能比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：對照組；B：模型組；C：實驗組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。下圖同。圖1 各組腦組織的神經(jīng)元凋亡率比較Note. A, Control group. B, Model group. C, Experiment group. Compared with the control group, *P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05. The same in the following figures.Figure 1 Comparison of neuronal apoptosis rates in the brain tissue of each group

注：(1)各組腦組織中Bcl-2、calpain-1蛋白的表達；(2)各組腦組織中Bcl-2蛋白表達統(tǒng)計分析；(3)各組腦組織中calpain-1蛋白表達統(tǒng)計分析。圖2 各組腦組織Bcl-2、calpain-1蛋白水平比較Note. (1) Calpain-1 and Bcl-2 protein levels in brain tissue of each group. (2) Bcl-2 protein levels. (3) Calpain-1 protein levels.Figure 2 Comparison of calpain-1 and Bcl-2 protein levels in the brain tissue of each group

注：(1)各組腦組織中Bcl-2 mRNA水平的統(tǒng)計分析；(2)各組腦組織中calpain-1 mRNA水平的統(tǒng)計分析。圖3 各組腦組織Bcl-2、calpain-1 mRNA水平比較Note. (1) Bcl-2 mRNA levels in brain tissue of each group. (2) Calpain-1 mRNA levels in brain tissue of each group.Figure 3 Comparison of Bcl-2 and calpain-1 mRNA levels in the brain tissue of each group

3 討論

ACI是人類死亡和致殘的主要原因[7]。目前臨床上治療此疾病的主要方式為溶栓治療，由于時間窗較狹窄，因此僅有小部分患者能接受溶栓治療。因此，選擇接近臨床實際情況的腦梗死動物模型進行藥物研究具有重要的價值。中藥制劑療效確切、安全性高、價格低廉，已經(jīng)廣泛運用于臨床治療中[8]。參麥注射液主要成分為紅參、麥冬，具有益血生津、補氣滋陰的作用，有文獻報道，參麥注射液可顯著提高急性腦梗死的治療效果，但機制研究較少[9-10]。因此，本研究通過構(gòu)建急性腦梗死小鼠模型并進行參麥注射液干預(yù)治療，探討其作用機制。

pMCAO模型具有操作性強和重復(fù)性高的優(yōu)點，是目前國際上應(yīng)用較為廣泛的腦梗死動物模型，模型構(gòu)建成功后可模擬腦梗死的病理過程進行缺血后繼發(fā)腦損傷的研究，并且數(shù)分鐘內(nèi)可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及凋亡等一系列繼發(fā)性腦損傷[11]。本實驗通過線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)構(gòu)建pMCAO模型小鼠，目的是研究參麥注射液對模型小鼠紅細胞免疫功能及凋亡的影響。參麥注射液是由生脈散改變劑型而成，包含人參皂甙、麥冬黃酮等有效成分[12]。人參皂甙可有效改善腦損傷組織的代謝，麥冬黃酮可改善腦細胞的能量缺乏及缺氧狀態(tài)。參麥注射液被廣泛地運用到心腦血管病、膿毒血癥、腫瘤、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病，并取得較好的療效。在治療腦血管疾病上，陳中明等[13]采用參麥注射液輔助治療急性腦梗死患者，發(fā)現(xiàn)治療后聯(lián)合用藥組明顯改善凝血功能，降低VEGF、GFAP 和 TNF-α水平，提示其具有抗凝、抗炎、改善血液循環(huán)，從而發(fā)揮療效。耿武軍等[14]發(fā)現(xiàn)參麥注射液通過上調(diào)Bcl蛋白和Bcl/Bax比率改善腦缺血再灌注損傷大鼠的腦損傷。紅細胞免疫是目前免疫學(xué)領(lǐng)域中重要的研究內(nèi)容，研究發(fā)現(xiàn)，機體發(fā)生腦梗死時，RBC-ICR升高，RBC-C3bR降低，從而降低機體的免疫功能[15]。本研究采用參麥注射液對急性腦梗死模型小鼠進行干預(yù)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組RBC-C3bR明顯高于模型組，RBC-ICR顯著低于模型組。結(jié)果表明了參麥注射液能夠改善模型小鼠的紅細胞免疫功能，與以往研究一致[13]。

Bcl-2家族在在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2可通過細胞凋亡信號途徑阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命[15]。calpain家族在腦缺血后細胞凋亡過程中扮演重要角色，研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后1 h，腦部皮層和海馬calpain活性明顯增高，再灌注后24 h calpain活性可再次達到最高水平[16]。calpain-1是calpain主要的亞家族成員之一，可裂解多種酶，選擇性降解細胞骨架蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等。calpain-1可通過裂解半胱氨酸蛋白酶Caspases-3、7、8等，并可調(diào)節(jié)Bcl家族介導(dǎo)凋亡。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和實驗組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細胞數(shù)顯著高于對照組，實驗組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細胞數(shù)明顯低于模型組小鼠，結(jié)果說明了參麥注射液能夠抑制神經(jīng)元的凋亡。推測其原因可能是參麥注射液具有降低氧自由基，減少腦組織損傷后脂質(zhì)過氧化物生成作用，且可促進ATP 合成，提高Na+-K+-ATP 酶活性及膜轉(zhuǎn)運電位，抑制Na+、K+內(nèi)流，減輕腦水腫，發(fā)揮神經(jīng)元的保護作用，抑制神經(jīng)元的凋亡。進一步研究其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠calpain-1蛋白和mRNA表達水平低于模型組，Bcl-2蛋白和mRNA表達水平高于模型組。結(jié)果說明，參麥注射液可通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，下調(diào)calpain-1蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，參麥注射液可改善急性腦梗死小鼠紅細胞功能和抑制神經(jīng)元凋亡，其可能的機制是下調(diào)calpain-1蛋白的表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，發(fā)揮腦組織神經(jīng)保護作用。