李佳岑，羅 瑤，曾 思

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院麻醉科， 成都 610041)

缺血再灌注是機體器官暫時性血流供應(yīng)不足后再次恢復(fù)血流灌注時產(chǎn)生的病理過程，如氧化應(yīng)激、異常炎癥、凋亡壞死等，盡管缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)，但是組織器官損傷并未減輕，如肺缺血再灌注，可導(dǎo)致肺毛細胞血管內(nèi)皮細胞以及肺泡上皮細胞受損，從而引起呼吸障礙[1-2]。缺血再灌注多發(fā)生于外科手術(shù)中，常見的處理方式為缺血預(yù)處理、遠距調(diào)節(jié)方式等[2-3]，其中缺血預(yù)處理主要有吸入七氟醚，作為全身麻醉中常用吸入型藥物，可減輕氣道阻力和炎癥，從而改善通氣功能和減輕組織缺血再灌注損傷，可控性和操作性較強，但是誘導(dǎo)期和恢復(fù)期容易產(chǎn)生不適，從而導(dǎo)致躁動，影響手術(shù)過程，同時在受到手術(shù)刺激時，會導(dǎo)致血液黏度升高，增加血栓形成的可能，影響手術(shù)治療以及預(yù)后效果[4-5]。亞甲藍是吩噻嗪類化合物，易透過血腦屏障，可有效穿過線粒體膜，減輕缺血再灌注引起的線粒體損傷，氧化型和還原型的特點保證了較強的抗氧化及增強代謝的能力[6]，但是，目前關(guān)于其能在缺血再灌注中的應(yīng)用并不多見，其是否能夠達到與七氟醚相同的療效，同時改善血液黏度，以及在缺血再灌注損傷中對機體血清及肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子影響的有待進一步考察，本文以大鼠為模型動物探討兩者差異，為實際應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只二級清潔雄性SD大鼠，體重180～220 g，由四川省人民醫(yī)院實驗室動物中心提供[SCXK(川)2018-15]，[SYXK(川)2018-110]。本研究使用大鼠的實驗過程均經(jīng)過我院倫理委員會的批準(zhǔn)。將60只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分成4組，每組15只。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚購自于恒瑞醫(yī)藥有限公司；亞甲藍購自于濟川藥業(yè)集團有限公司；二甲基亞砜、PBS、甲醇、戊巴比妥鈉等均購自于Sigma公司；ELISA試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

SD大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分成四組，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。稱重后于腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)，動物麻醉后取仰臥位固定于手術(shù)臺上并消毒。于尾靜脈注射肝素100 U/kg，氣管切開后插管并行正壓通氣，保持大鼠呼吸頻率為每分鐘70次，潮氣量穩(wěn)定在8.0～9.0 mL/kg范圍內(nèi)。于左側(cè)胸骨第5肋間開胸，隨后于左心室近心尖處注射肝素500 U/kg，便于分離左側(cè)肺動脈。用無損傷血管鉗夾阻斷近心端左肺動脈，吸氣末則用血管鉗阻斷左主支氣管，造成左肺缺血。假手術(shù)組(空白對照組)只需分離大鼠左側(cè)肺門和肺動靜脈，無需進行阻斷。肺缺血再灌注組(IR對照組)在肺缺血1 h后放開，隨后再灌注2 h即可。MB組和S組建模方法同IR組，其中假手術(shù)組和IR組灌注前5 min于腹腔注射生理鹽水即可，而MB組灌注前5 min于腹腔注射5 mg/kg 亞甲藍，而S組需在灌注前5 min于呼吸管上添加七氟醚，并保持肺中檢測到的七氟醚濃度穩(wěn)定在2.1%即可。

1.3.1 檢測指標(biāo)

血液流變學(xué)指標(biāo)的檢測：分別于麻醉前 (T0)、麻醉誘導(dǎo)后30 min (T1)、灌注2 h (T2)，檢查患者紅細胞變形指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)、血漿黏度。并于灌注2 h 后，經(jīng)麻醉處死前先空腹采外周靜脈血5 mL，3000 r /min離心20 min，于-20℃暫存。經(jīng)麻醉后處死，取左肺組織，將其分成2等份。一份用于檢測肺組織濕/干質(zhì)量比，即生理鹽水沖洗并去除多余水分稱肺濕重，于80℃烘烤24 h后稱干質(zhì)量，計算濕/干質(zhì)量比。另一半肺組織制成10%勻漿液，4℃ 3000 r/min離心10 min，采用BCA法測蛋白濃度檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)以及三磷酸腺苷(ATP)含量。按相應(yīng)酶聯(lián)免疫試劑盒說明操作測定血清和肺組織勻漿液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比

MB組、S組的肺組織濕/干質(zhì)量比顯著高于假手術(shù)組，且顯著低于IR組，MB組、S組的肺濕重顯著低于IR組，其中MB組的肺濕重顯著高于假手術(shù)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。MB組、S組的肺濕重和濕/干質(zhì)量比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.2 四組大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)

MB組、S組的SOD、ATP水平顯著低于對照組，顯著高于IR組，同時MDA和ROS顯著高于對照組，顯著低于IR組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而MB組、S組各氧化應(yīng)激指標(biāo)組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表1 四組大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與IR組相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表2 四組大鼠的肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與IR組相比，bP<0.05。

Note. Compared with Sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

2.3 四組大鼠肺組織炎性指標(biāo)

MB組、S組肺組織各炎性指標(biāo)水平顯著高于對照組，顯著低于IR組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而MB組各炎性指標(biāo)略高于S組，但組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

2.4 四組大鼠血清炎性指標(biāo)

MB組、S組血清各炎性指標(biāo)水平顯著高于對照組，顯著低于IR組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而MB組、S組各炎性指標(biāo)組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表4。

2.5 兩組各時間段血液流變學(xué)變化

MB組、S組T1、T2期的紅細胞變形指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)和血漿黏度均低于T0期，而IR組T1、T2期各指數(shù)均高于T0期，MB組T1、T2期各指數(shù)均低于S組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見表5。

3 討論

肺缺血再灌注損傷是機體組織器官因血流供應(yīng)不足或受阻而迅速引起的肺組織損傷，如肺毛細胞血管內(nèi)皮細胞以及肺泡上皮細胞受損等，與ROS大量產(chǎn)生而引起的氧化應(yīng)激，組織炎癥細胞聚集，或者炎性因子的大量產(chǎn)生密切關(guān)聯(lián)[6]。缺血再灌注損傷常見的處理方式為缺血預(yù)處理、遠距調(diào)節(jié)方式等，常用的模型為結(jié)扎法制作的肺缺血再灌注損傷。其中，缺血預(yù)處理主要有吸入七氟醚，但關(guān)于腹腔注射亞甲藍的應(yīng)用效果并未得到廣泛認(rèn)可，因此本文以SD大鼠肺缺血再灌注損傷為模型探討七氟醚、亞甲藍在調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血液流變學(xué)方面的區(qū)別，旨在為亞甲藍的應(yīng)用提供依據(jù)。研究顯示，MB組、S組的肺組織濕/干質(zhì)量比顯著高于假手術(shù)組，且顯著低于IR組，表明大鼠肺IR后存在明顯的水腫，而經(jīng)過七氟醚或者亞甲藍預(yù)處理后，均可有效減輕水腫，但不能完全避免水腫的發(fā)生，而MB組、S組的肺濕重和濕/干質(zhì)量比無統(tǒng)計學(xué)差異，表明兩組對于水腫的改善效果相近。研究發(fā)現(xiàn)MB組、S組的SOD、ATP水平顯著低于對照組，顯著高于IR組，同時MDA和ROS顯著高于對照組，顯著低于IR組，與孫雷等報道相符[1,7]。進一步表明大鼠肺IR損傷后存在明顯氧化應(yīng)激反應(yīng)，而經(jīng)過七氟醚或者亞甲藍預(yù)處理后，均可一定程度減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，而MB組、S組各氧化應(yīng)激指標(biāo)組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明腹腔注射亞甲藍在改善氧化應(yīng)激方面能夠達到與七氟醚相同的療效。分析認(rèn)為，大鼠肺IR后肺細胞上線粒體電子傳遞鏈的電子滲漏到氧上以及細胞中酶的催化反應(yīng)導(dǎo)致ROS增多，ROS不可逆地破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)構(gòu)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生MDA，破壞細胞膜，還導(dǎo)致細胞酶系統(tǒng)遭受破壞，使得SOD水平降低，同時SOD 的降低又導(dǎo)致不能正常清除ROS活性，使得細胞內(nèi)氧化還原失去平衡，阻斷能量代謝導(dǎo)致ATP水平降低，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)被破壞和細胞死亡[7-8]。MB組大鼠接受亞甲藍預(yù)處理后，可通過增強Cyt C氧化酶的活性而促進ATP的生成，通過激活Nrf2/ARE通路而增強組織抗氧化作用，從而降低ROS水平，故而也降低MDA水平和增加SOD水平，減輕了氧化應(yīng)激對肺組織的損傷[9-10]。而S組接受七氟醚預(yù)處理，通過優(yōu)化大鼠有氧代謝率和擴張支氣管及肺血管，從而增加肺組織供氧和改善肺順應(yīng)性，同時在體內(nèi)代謝過程中可產(chǎn)生過氧化物，提前激活抗氧化機制以及清除氧自由基，改善氧化應(yīng)激水平[11]。盡管，兩者作用機制不同，但均可改善大鼠肺缺血再灌注損傷狀態(tài)，從而保護對肺損傷，為亞甲藍在肺缺血再灌注損傷中的應(yīng)用提供依據(jù)。

表3 四組大鼠肺組織炎性指標(biāo)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與IR組相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表4 四組大鼠血清炎性指標(biāo)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與IR組相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表5 兩組各時間段血液流變學(xué)的變化

注：與T0期相比，aP<0.05；與IR組同時間點相比，bP<0.05；與MB組相同時間點相比，cP<0.05。

Note. Compared with the T0 phase,aP<0.05. Compared with the same time point of the IR group,bP<0.05. Compared with the same time point of the MB group,cP<0.05.

當(dāng)機體發(fā)生缺血再灌注損傷時，機體病灶部位可產(chǎn)生大量ROS，同時趨化和激活大量中性粒細胞、巨噬細胞，從而刺激免疫細胞產(chǎn)生大量炎癥因子并釋放入血，如 IL-1β、IL-6、TNF-α[5,12]。炎癥細胞因子是引起肺泡損傷的重要原因，單核細胞生成的TNF-α可增強中性粒細胞的吞噬作用，促進IL-1β、IL-6的分泌，進而啟動炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，促進血管內(nèi)皮細胞與中性粒細胞的粘附，從而增加肺血管通透性，使得肺組織炎癥因子水平進一步增加，加劇局部炎癥反應(yīng)，引起肺細胞損傷。本次研究結(jié)果顯示，MB組、S組肺組織和血清各炎性指標(biāo)水平顯著高于對照組，顯著低于IR組，表明大鼠肺IR損傷后存在明顯的炎癥反應(yīng)，而經(jīng)過七氟醚或者亞甲藍預(yù)處理后，均可一定程度減輕炎癥反應(yīng)，而MB組、S組各炎癥因子水平組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明腹腔注射亞甲藍在改善炎癥方面能夠達到與七氟醚相同的療效。七氟醚在清除ROS的同時，可抑制內(nèi)皮和中性粒細胞間的粘附，減輕肺組織損傷，減少損傷刺激，同時下調(diào)肺組織細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，從而維持細胞膜和基質(zhì)穩(wěn)定性，使得細胞正常運轉(zhuǎn)，從而降低了炎癥刺激[7,13]，故而表現(xiàn)為IL-1β、IL-6、TNF-α水平的降低。MB組大鼠接受亞甲藍預(yù)處理后，由于其良好的膜通透性使之容易進入線粒體中，其的高度自動氧化特性使之可以在氧化態(tài)和還原態(tài)之間自由切換，從而維持線粒體電子傳遞鏈的運轉(zhuǎn)，穩(wěn)定線粒體功能[14-15]，降低ROS水平，避免細胞氧化應(yīng)激引起的細胞損傷和凋亡，從而降低炎癥刺激和炎癥因子水平。氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的細胞損傷和凋亡可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，本次研究中發(fā)現(xiàn)使用七氟醚或亞甲藍預(yù)處理后，均可改善大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)和降低炎癥因子水平，可相互佐證，同時通過肺組織水腫狀態(tài)可以直觀反應(yīng)。但進一步研究血液流變學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，IR組T1、T2期紅細胞變形指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)和血漿黏度均高于T0期，MB組T1、T2期各指數(shù)均低于S組，表明亞甲藍、七氟醚均可改善血液黏度，但亞甲藍效果更優(yōu)，推測是亞甲藍能夠通過改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及減少血管阻力，從而使血液黏度降低，穩(wěn)定血流動力學(xué)狀態(tài)，降低血栓形成風(fēng)險。

綜上所述，亞甲藍與七氟醚均可改善肺缺血再灌注損傷大鼠中肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)，降低血清及肺組織炎癥因子水平，改善水腫狀態(tài)，但亞甲藍改善血液黏度效果更顯著，可有效降低血栓形成風(fēng)險。