韓昌旭 侯彬彬 晉亮 張振穎

1香港大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科 518000；2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科 116000；3空軍特色醫(yī)學(xué)中心皮膚科，北京 100142

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌及其復(fù)合體引起的皮膚、皮下組織及附近淋巴管的慢性感染性疾病，是最常見的皮膚深部真菌病。孢子絲菌屬于雙相性病原真菌，自然環(huán)境中呈腐生狀態(tài)生長(zhǎng)，無(wú)致病性，入侵宿主后其生存環(huán)境發(fā)生驟變，菌體為適應(yīng)變化的環(huán)境發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換，呈寄生狀態(tài)生長(zhǎng)并致?。?］。深入探究孢子絲菌感染宿主的過(guò)程對(duì)選擇新的藥物作用靶點(diǎn)和研發(fā)新的抗真菌藥物至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究特定的細(xì)胞或組織在特定的功能狀態(tài)下基因組產(chǎn)生的全部轉(zhuǎn)錄物的種類、結(jié)構(gòu)和功能，可以揭示生物學(xué)進(jìn)程或疾病發(fā)生的分子機(jī)制。探究孢子絲菌致病的酵母相形成過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化將有助于闡明孢子絲菌致病性形成的分子機(jī)制，開發(fā)新的抗真菌藥物作用靶位。本研究通過(guò)RNA-seq高通量測(cè)序方法，對(duì)孢子絲菌菌絲及酵母相細(xì)胞的兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析，組裝獲得篩選后的單基因簇（unigene），再基于基因在不同樣品中的表達(dá)量識(shí)別差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行模式聚類、功能注釋以及富集性分析來(lái)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

材料與方法

一、申克孢子絲菌菌株及培養(yǎng)

申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10268為大連醫(yī)科大學(xué)真菌中心保存菌株，用沙氏液體培養(yǎng)基（SDA）在25℃振蕩（100 r/min）培養(yǎng)96 h獲得菌絲相菌體，轉(zhuǎn)種于腦心浸液（BHI）液體培養(yǎng)基，37℃振蕩（100 r/min）培養(yǎng)36 h獲得酵母相菌體。4℃下3 000×g離心5 min，棄上清液收集菌體，部分用于制片、鏡檢，其他在-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

二、總RNA提取

分別取孢子絲菌菌絲相和酵母相200 mg，液氮研磨，采用植物總RNA提取試劑盒（美國(guó)Promega公司），按照說(shuō)明書提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A260和A280，計(jì)算RNA純度和濃度。

三、mRNA富集純化

以帶有Oligo（dT）的磁珠（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）富集真核生物mRNA，按照mRNA純化試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行，使用生物素-磁珠法從總RNA中富集純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280，計(jì)算RNA純度和濃度。

四、鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建

加入碎片化緩沖液將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I和RNase H合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP磁珠純化雙鏈cDNA。對(duì)純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。之后用USER酶降解含有堿基U的cDNA第二鏈，使最終的測(cè)序信息都來(lái)自于第一鏈cDNA，從而保留mRNA的鏈方向性。最后進(jìn)行PCR（美國(guó)Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到鏈特異性cDNA文庫(kù)。

使用Qubit3.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1mg/L，隨后使用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)插入片段的大小，符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求分組后進(jìn)行HiSeq測(cè)序。共取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的RNA樣品混合后進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，取所有樣本檢測(cè)的平均值。

五、數(shù)據(jù)分析

將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)（clean reads），將短reads進(jìn)行拼接組裝獲取較長(zhǎng)的unigene序列集。將clean reads與組裝獲取的unigene序列進(jìn)行比對(duì)，得到Mapped Data，進(jìn)行插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估；根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析，對(duì)篩選后的基因（unigene）進(jìn)行功能注釋，包括與數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO、Pfam）的比對(duì)，同時(shí)還進(jìn)行編碼區(qū)序列（CDS）預(yù)測(cè)及基因在每個(gè)樣品中的表達(dá)量分析。最后，應(yīng)用功能軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行模式聚類、功能注釋以及富集性分析。

結(jié)果

一、測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

1.測(cè)序reads評(píng)估：評(píng)估顯示原始序列中含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads。菌絲相菌體clean reads達(dá)到97.72%，酵母相菌體達(dá)到97.88%（圖1），獲得14.76 Gb有效數(shù)據(jù)（clean Data），各樣品有效數(shù)據(jù)均達(dá)到7.36 Gb，Q30堿基占比（堿基質(zhì)量值≥30）≥94.85%，即14.76 Gb的有效數(shù)據(jù)中94.85%的堿基正確率為99.9%。將各樣品的clean reads進(jìn)行組裝，獲得43 863條unigene，其中17 667條長(zhǎng)度在1 kb以上?；趗nigene庫(kù)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，共獲得11 783條簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記。

圖1 申克孢子絲菌測(cè)序reads評(píng)估1A：菌絲相菌株；1B：酵母相菌株

2.測(cè)序飽和度分析：使用各樣品的Mapped Reads對(duì)檢測(cè)到的基因數(shù)目的飽和情況進(jìn)行模擬，繪制曲線圖（圖2），各曲線越往右延伸，斜率越小，逐漸趨于平坦，提示各樣品隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，新檢測(cè)到的基因越來(lái)越少，趨于飽和，有效測(cè)序數(shù)據(jù)量充足。

3.測(cè)序隨機(jī)性評(píng)價(jià)：本研究中轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)為鏈特異性建庫(kù)，出現(xiàn)了GC分離的現(xiàn)象，且整個(gè)測(cè)序過(guò)程基本穩(wěn)定不變，呈水平線。見圖3。

4.比對(duì)分析：將各樣品的有效數(shù)據(jù)與組裝得到的轉(zhuǎn)錄子或unigene庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，菌絲相與早期酵母相的clean reads分別為49 086 618、49 322 654，mapped reads（比對(duì)到Transcript或unigene的Reads）分別為46 356 350、46 833 812，匹配率分別為94.44%、94.95%。將Mapped Reads用于后續(xù)的分析。

二、差異表達(dá)基因分析

1.酵母相差異表達(dá)基因數(shù)量分析：以差異倍數(shù)≥2或≤1/2且錯(cuò)誤率＜0.01作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。與菌絲相相比，酵母相10 969條基因表達(dá)上調(diào)，199條下調(diào)，29 163條未見改變。見圖4。

圖2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)飽和度模擬圖

圖3 申克孢子絲菌菌絲相（3A）和酵母相（3B）菌體堿基含量分布圖

2.差異表達(dá)基因的GO功能注釋：差異基因GO富集柱狀圖顯示，差異基因主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞組分生物代謝等過(guò)程。挑選富集最顯著的30條GO詞條，其中29條與生物過(guò)程相關(guān)，1條與分子功能相關(guān)，見圖5。

3.差異表達(dá)基因的通路分析：對(duì)差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因參與蛋白磷酸化、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞蛋白修飾、小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微管形成、ATP合成偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程（圖6）。參與真菌形態(tài)形成的兩個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK及雙組分信號(hào)通路中的16條基因和參與幾丁質(zhì)合成代謝的16條基因均被證實(shí)在早期酵母相上調(diào)表達(dá)。表1列舉了在酵母相中表達(dá)上調(diào)的3條參與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因、3條雙組分信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因和4條幾丁質(zhì)合成代謝的基因。

討論

對(duì)孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換過(guò)程進(jìn)行深入研究不僅有助于深刻理解孢子絲菌病的發(fā)病機(jī)制，還有助于研發(fā)新型的抗真菌藥物。迄今，孢子絲菌的基因組序列尚未被完全公布及注釋，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可作為基因組學(xué)研究的一種有利補(bǔ)充。

在溫度誘導(dǎo)下由菌絲相向酵母相發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程被認(rèn)為是孢子絲菌毒力基因表達(dá)及致病性形成的過(guò)程［2］。雖然Pho85［3］、蛋白激酶C［4］、腦苷脂［5］被認(rèn)為是與孢子絲菌形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)的毒力分子，但啟動(dòng)其雙相轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制尚不明確。我們先前研究證實(shí)，菌絲相孢子絲菌在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h即出現(xiàn)酵母相的部分形態(tài)特征［6］，故本研究中我們比較菌絲相和早期酵母相轉(zhuǎn)錄組圖譜的差異，以期明確孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換過(guò)程的啟動(dòng)機(jī)制。

本研究表明，與菌絲相比較，酵母相上調(diào)表達(dá)的基因多達(dá)10 969條，下調(diào)表達(dá)的基因僅為199條。進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行模式聚類、功能注釋以及富集性分析，表明上述基因參與蛋白磷酸化、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞蛋白修飾、小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微管形成、ATP合成偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)等諸多過(guò)程，提示孢子絲菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程涉及的機(jī)制十分復(fù)雜。

圖4 酵母相和菌絲相申克孢子絲基因差異表達(dá)圖FPKM：fragments per kilobase of exon per million reads mapped，每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段

圖5 酵母相和菌絲相申克孢子絲菌差異表達(dá)基因GO富集柱狀圖

圖6 酵母相和菌絲相申克孢子絲菌差異表達(dá)基因KEGG分類圖

表1 申克孢子絲菌酵母相較菌絲相表達(dá)上調(diào)的部分基因的功能注釋

值得關(guān)注的是參與真菌形態(tài)形成的兩個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK及雙組分信號(hào)通路中的16條基因也被證實(shí)在早期酵母相上調(diào)表達(dá)。MAPK通路在病原真菌中具有重要調(diào)控功能，參與細(xì)胞壁的完整性通路、孢子壁的完整性通路、孢子壁的組裝通路、菌絲的生長(zhǎng)通路、信息素的反應(yīng)通路、高滲透性甘油通路的信號(hào)調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控病原真菌的生長(zhǎng)、繁殖、應(yīng)激及形態(tài)形成［7］。MAPK通路受控于其上游信號(hào)傳導(dǎo)通路——雙組分信號(hào)通路，而后者在病原真菌中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞壁的生物合成、毒力基因的表達(dá)、耐藥性、形態(tài)形成等［8-10］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，孢子絲菌雙組分信號(hào)系統(tǒng)組氨酸蛋白激酶DRK1和MAPK通路中絲氨酸蛋白激酶Ste20的蛋白水平在酵母相早期上調(diào)，DRK1/Ste20基因表達(dá)被干擾后，其向酵母相形態(tài)轉(zhuǎn)化受阻，菌株毒力減弱，提示二者在孢子絲菌形態(tài)轉(zhuǎn)化及致病性形成過(guò)程中起重要作用［11］。本研究中我們?cè)诮湍赶嘀需b定出上調(diào)表達(dá)的9條MAPK通路基因和7條雙組分信號(hào)通路基因，推測(cè)雙組分信號(hào)通路、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與孢子絲菌對(duì)外界環(huán)境因素的感知、菌絲相向酵母相的形態(tài)轉(zhuǎn)化及菌體致病性形成的過(guò)程。

幾丁質(zhì)又稱甲殼素，是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，既是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，也是其重要毒力因子［12］。細(xì)胞壁是真菌抵御滲透壓和外界機(jī)械損傷的重要屏障，幾丁質(zhì)富集是真菌細(xì)胞抵抗或適應(yīng)惡劣的外部環(huán)境的主要手段，而幾丁質(zhì)暴露會(huì)造成分生孢子的毒力減弱，有利于誘發(fā)抗真菌免疫應(yīng)答，減輕組織炎癥損傷［13］。幾丁質(zhì)合成酶是控制幾丁質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。本研究鑒定出包括幾丁質(zhì)合成酶及內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在內(nèi)的16條基因在酵母相上調(diào)表達(dá)，提示孢子絲菌菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)換的早期幾丁質(zhì)合成代謝發(fā)生改變，可能參與孢子絲菌酵母相的形態(tài)形成及致病性產(chǎn)生。

綜上，我們應(yīng)用RNA-seq高通量測(cè)序方法對(duì)早期酵母相及菌絲相申克孢子絲菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行比較，差異表達(dá)基因的鑒定與功能注釋有助于我們對(duì)孢子絲菌致病性形成的分子機(jī)制有更深刻的認(rèn)識(shí)，也為孢子絲菌病治療藥物的研發(fā)提供新的思路，如脊椎動(dòng)物體內(nèi)不存在雙組分信號(hào)蛋白及幾丁質(zhì)成分，故二者均可作為理想的藥物作用靶點(diǎn)。將來(lái)我們擬通過(guò)基因敲除或干擾技術(shù)構(gòu)建基因缺陷株，對(duì)重要差異基因做進(jìn)一步的功能研究。