樹葉 羅鴦鴦 羅勇奇 湯建萍 肖嶸

1湖南省兒童醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)沙 410007；2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)沙 410008

過敏性紫癜的病因復(fù)雜，常在特定的遺傳易感性基礎(chǔ)上，由感染和過敏等環(huán)境因素誘發(fā)，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）作為具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，可以防止機(jī)體免疫系統(tǒng)過度活化，維持免疫平衡狀態(tài)，避免機(jī)體出現(xiàn)一系列自身免疫疾病。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，某些自身免疫性疾病伴隨出現(xiàn)CD4+CD25+Treg數(shù)量下降和/或功能損傷［1-3］。叉頭框蛋白3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）主要表達(dá)于Treg，對(duì)該細(xì)胞的發(fā)育、分化成熟、維持免疫抑制功能起關(guān)鍵作用，被公認(rèn)為CD4+CD25+Treg的標(biāo)志［4-5］。Foxp3基因?qū)S持免疫平衡有重要作用，其移碼突變可造成編碼蛋白scurfin缺陷，進(jìn)一步造成小鼠致死性淋巴細(xì)胞增殖性疾病［5］。影響Foxp3基因表達(dá)的原因很多，近年研究表明，表觀遺傳學(xué)甲基化狀態(tài)對(duì)人Treg的Foxp3基因具有重要的調(diào)控作用［6-7］。我們檢測(cè)過敏性紫癜患者CD4+CD25+Treg比例和Foxp3基因mRNA及啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，探討甲基化調(diào)控Foxp3基因在過敏性紫癜發(fā)病機(jī)制中的作用。

對(duì)象與方法

一、一般資料

2015年3月至2016年10月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科收集20例過敏性紫癜住院患者和20例健康體檢者。20例患者均符合過敏性紫癜國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)（下肢出現(xiàn)紫癜或瘀點(diǎn)，血小板數(shù)目正常，合并以下任意1項(xiàng)：腹痛、關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)腫痛、腎臟受累、組織病理示IgA血管炎）［8］，排除其他原因所致的血管炎和紫癜，無其他免疫系統(tǒng)疾病、無糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療史。所有病例均有皮膚紫癜癥狀，其中12例伴關(guān)節(jié)腫痛，6例合并腹痛及糞便隱血，11例合并腎臟損害（出現(xiàn)蛋白尿和/或尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性），部分患者同時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)、消化道和腎臟損害，參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行臨床評(píng)估，評(píng)分為4.7±1.65?；颊呓M男女比例13∶7，年齡（26.15±18.13）歲。健康對(duì)照組中男女比例12∶8，年齡（28.56±17.45）歲，無過敏性疾病或免疫性疾病史。兩組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)湖南省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：HCHLL-2016-006），患者均簽署知情同意書。

二、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）及CD4+T細(xì)胞的分離

采集受試者外周靜脈血60 ml，肝素抗凝，采用人淋巴細(xì)胞分離液（瑞典GE Healthcare公司）通過密度梯度離心法分離PBMC。采用人CD4+T細(xì)胞陽性磁珠分選試劑盒（德國(guó)Miltenyi公司）分選CD4+T細(xì)胞亞群。

三、流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+Treg比例

參考流式細(xì)胞儀檢測(cè)說明書，將分離的CD4+T細(xì)胞首先進(jìn)行細(xì)胞膜CD4-FITC、CD25-PerCP單克隆抗體雙標(biāo)記，破膜固定后進(jìn)行FoxP3-PE單克隆抗體胞內(nèi)染色。CD4-FITC、CD25-PerCP、Foxp3-PE單克隆抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）和CellQuest software軟件分析CD4+CD25+Treg的比例。

四、熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析CD4+T細(xì)胞中Foxp3 mRNA水平

參照說明書，采用Trizol RNA提取試劑（美國(guó)Life Science公司）提取CD4+T細(xì)胞亞群的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度。采用PrimeScriptTMRT試劑盒（日本TaKaRa公司）按照說明書合成cDNA第一鏈。采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），以cDNA為模板，配制RT-PCR反應(yīng)體系：上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，無酶水7.2 μl，2×SYBR Premix Ex Taq realtime PCR mix 10 μl，cDNA 2 μl，總體積20 μl。Foxp3正向引物5′-CAAGTTCCACAACATGCGAC-3′，反向引物5′-ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT-3′；以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，正向引物5′-GCACCACAC CTTCTACAATGAGC-3′，反向引物5′-GGATAGCAC AGCCTGGATAGCAAC-3′。由上海鉑尚基因生物公司合成引物。應(yīng)用Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示靶基因的相對(duì)表達(dá)量，患者組ΔCt=患者樣品Ct值均值-內(nèi)參Ct值，對(duì)照組ΔCt=對(duì)照樣品Ct值均值-內(nèi)參Ct值，ΔΔCt=患者組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

五、Foxp3啟動(dòng)子甲基化片段擴(kuò)增與測(cè)序

參照說明書，使用基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取CD4+T細(xì)胞總DNA。使用EpiTect?Bisulfite試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）對(duì)總DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。使用甲基化特異性PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）擴(kuò)增Foxp3啟動(dòng)子甲基化片段。參考UCSC Genome Browser上人Foxp3基因的DNA序列，采用軟件MethPrimer設(shè)計(jì)甲基化引物，正向引物5′-TATA ATTAAGAAAAGGAGAAATATAGAGAG-3′，反向引物5′-TCAACCTAACTTATAAAAAACTATCAC-3′。

將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pGEM-T easy vector（美國(guó)Promega公司）連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技有限公司），在氨芐西林（+）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（+）異丙基硫代半乳糖苷（+）LB平板上培養(yǎng)。根據(jù)藍(lán)白挑選原則，選擇10個(gè)陽性克隆，送至深圳華大基因公司測(cè)序。每例受試者選擇10個(gè)克隆，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，分析CG位點(diǎn)的變化，進(jìn)而計(jì)算甲基化水平。若CG位點(diǎn)全部保持不變，則甲基化水平為1，若全部變化，則為0。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較樣本均數(shù)，單因素直線相關(guān)分析評(píng)估指標(biāo)的相關(guān)性，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、患者及健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+Treg比例

見圖1、表1。與健康對(duì)照組相比，過敏性紫癜患者外周血Treg在CD4+T細(xì)胞中的百分比顯著降低（P＜0.05）。

二、患者及健康對(duì)照組CD4+T細(xì)胞中Foxp3基因mRNA表達(dá)水平及Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平

與健康對(duì)照組相比，患者組外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見表1。

亞硫酸氫鈉測(cè)序結(jié)果顯示，患者組外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)8個(gè)CG位點(diǎn)的總甲基化水平較健康對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）（表1）?；颊咂骄谆揭草^健康對(duì)照組顯著升高（t=3.610，P＜0.01）。見圖2。

三、患者CD4+T細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與臨床病情評(píng)分和腎損害的相關(guān)性

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例與健康對(duì)照組相比，過敏性紫癜組CD4+CD25+Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例顯著降低

表1 過敏性紫癜患者外周血CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例以及Foxp3 mRNA和基因啟動(dòng)子區(qū)總甲基化水平（±s）

表1 過敏性紫癜患者外周血CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例以及Foxp3 mRNA和基因啟動(dòng)子區(qū)總甲基化水平（±s）

組別患者組健康對(duì)照t值P值例數(shù)20 20 Treg比例（%）1.668±0.959 2.741±1.131 2.552＜0.05 Foxp3 mRNA（2ΔΔCt）0.380±0.226 1 9.503＜0.01 Foxp3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平0.712±0.164 0.453±0.147 3.610＜0.01

圖2 過敏性紫癜（HSP）患者及健康對(duì)照組CD4+T細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子8個(gè)CG位點(diǎn)平均甲基化水平HSP患者（20例）各CG位點(diǎn)的平均甲基化水平較健康對(duì)照組（20例）明顯升高

患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3啟動(dòng)子區(qū)總甲基化水平與CD4+CD25+Treg比例呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.490，P＜0.05），但與臨床病情評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r＝0.486，P＜0.05），見圖3、4。腎損害組（11例）CD4+T細(xì)胞Foxp3啟動(dòng)子區(qū)總甲基化水平（0.749±0.095）顯著高于無腎損害組（9例，0.643±0.075），P＜0.05。

討論

DNA甲基化主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，并且DNA甲基化的信息可隨DNA的復(fù)制而遺傳，是表觀遺傳學(xué)最重要、最經(jīng)典、研究最深入的內(nèi)容之一。CpG島位于基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他區(qū)域，是基因轉(zhuǎn)錄的起始區(qū)。DNA甲基化主要發(fā)生在5′-CpG-3′的C上，生成5-甲基胞嘧啶，甲基通過阻礙蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合降低基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)基因表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、硬皮病、干燥綜合征中，多種基因受到DNA甲基化的調(diào)控而過表達(dá)或低表達(dá)，在不同程度上影響了疾病的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后［10-12］。環(huán)境誘發(fā)因素如細(xì)菌、病毒、特定過敏原、日光、硅、疫苗或者藥物可以通過DNA甲基化途徑，影響某些基因的表達(dá)，在一定程度上參與發(fā)病。

圖3 20例過敏性紫癜患者Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與CD4+CD25+Treg百分比呈顯著負(fù)相關(guān)

圖4 20例過敏性紫癜患者Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與病情評(píng)分呈顯著正相關(guān)

CD4+CD25+Treg是具有免疫抑制調(diào)節(jié)功能的成熟T細(xì)胞亞群，其數(shù)量下降和/或功能降低有可能破壞機(jī)體固有的免疫平衡，引起自身免疫性疾病。Tselios等［13］發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg的數(shù)量和SLE的疾病活動(dòng)程度呈明顯負(fù)相關(guān)，其改變可靈敏地反映SLEDAI的變化，故可以作為一種評(píng)價(jià)SLE疾病活動(dòng)度的生物標(biāo)記?；顒?dòng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+CD25+Treg數(shù)量降低，并且與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情活動(dòng)性評(píng)分、C反應(yīng)蛋白及紅細(xì)胞沉降率呈負(fù)相關(guān)［14］。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行期銀屑病患者外周血中CD4+CD25+Treg數(shù)量較健康人明顯下降，治療后和疾病緩解期Treg數(shù)量上升［15］。Antiga等［16］用流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性硬化和硬斑病患者的皮損和外周血中，CD4+CD25+Treg比例和白細(xì)胞介素10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的表達(dá)均比健康人減少。

我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過敏性紫癜組較健康對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞中Foxp3基因表達(dá)降低，CD4+CD25+Treg百分比下降。推測(cè)Treg數(shù)量下降導(dǎo)致免疫抑制功能降低，破壞患者的免疫自穩(wěn)狀態(tài)，誘發(fā)過度免疫反應(yīng)，這可能是過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制之一。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，患者組較健康對(duì)照組CD4+T細(xì)胞中Foxp3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯升高。上述結(jié)果證實(shí)，患者Foxp3基因和Treg的表達(dá)下降受到DNA甲基化的調(diào)控［6-7］。最后，我們分析探討Foxp3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與CD4+CD25+Treg比例呈顯著負(fù)相關(guān)，但與臨床病情評(píng)分呈顯著正相關(guān)，且腎損害組CD4+T細(xì)胞Foxp3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯升高。提示過敏性紫癜患者CD4+T細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，抑制Foxp3基因，進(jìn)一步影響Treg的產(chǎn)生，這可能是過敏性紫癜免疫紊亂的發(fā)病機(jī)制之一，需要進(jìn)一步深入研究。