楊驥 楊雪 楊潔 李明

1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200040；3上海市血液中心 200051

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種病譜性的自身免疫性疾病，可累及多器官多系統(tǒng)。SLE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但免疫失衡與其發(fā)病密切相關(guān)。既往研究揭示，效應(yīng)性T細(xì)胞如分泌白細(xì)胞介素17（IL-17）的CD4+T（Th17）細(xì)胞、濾泡輔助性T（Tfh）細(xì)胞和分泌IL-9的CD4+T（Th9）細(xì)胞在SLE患者中增殖，并與狼瘡發(fā)病密切相關(guān)［1-7］。Tfh細(xì)胞主要輔助B細(xì)胞活化和抗體分泌，其與SLE中自身抗體分泌密切相關(guān)，因此可作為SLE的治療靶點(diǎn)［5-6，8-9］。既往研究表明，黃芩苷具有抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用，臨床一般用于急慢性肝炎的輔助治療［10-11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分化，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分化和促炎效應(yīng)［12］。但迄今國內(nèi)外未見黃芩苷對狼瘡鼠動(dòng)物模型體內(nèi)外Tfh細(xì)胞的調(diào)控研究。本研究中我們首次通過狼瘡鼠模型研究黃芩苷對狼瘡腎炎的治療作用，并研究體內(nèi)外黃芩苷對狼瘡鼠Tfh細(xì)胞的調(diào)控作用，以進(jìn)一步明確黃芩苷在SLE臨床治療中的潛力。

材料與方法

一、材料

MRL/lpr狼瘡鼠來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2003-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（滬）2013-0039］，是由于Fas分子表達(dá)缺陷、淋巴細(xì)胞不能正常凋亡、T和B淋巴細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的自身免疫炎癥損傷性模型；黃芩苷（相對分子質(zhì)量446.36）來自上海同田生物技術(shù)有限公司（純度98%，高效液相色譜法測定，生理氯化鈉溶液溶解備用）；CD4、C-X-C趨化因子受體5（CXCR5）、程序性死亡蛋白1（PD-1）和IL-21流式細(xì)胞儀檢測抗體均來自美國BD公司；離子霉素、佛波酯、布雷非德菌素A均來自美國Sigma公司；IL-6和IL-21來自美國Peprotech公司，PBS溶解后使用；抗CD3和CD28抗體來自美國BD公司；尿蛋白檢測試劑盒來自南京建成生物工程研究所。幼稚T細(xì)胞分選磁珠來自美國Life Technologies公司；流式細(xì)胞儀為美國BD Bioscience公司產(chǎn)品。

二、方法

1.MRL/lpr狼瘡鼠和黃芩苷治療：8只12周齡雌性狼瘡鼠飼養(yǎng)在SPF級動(dòng)物房，體重（29.9±2.6）g，通過隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，每組4只。前期研究顯示，腹腔注射200 mg/kg黃芩苷可有效改善狼瘡腎炎病情［12］，因此本次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣選用200 mg/kg黃芩苷腹腔注射每日1次，治療4周，對照組同法腹腔注射生理氯化鈉溶液。第4周治療結(jié)束時(shí)收集24 h尿液，通過考馬斯亮藍(lán)法檢測尿蛋白含量。然后處死小鼠，測量體重，摘取小鼠脾臟，從脾臟中分離單個(gè)核細(xì)胞，用標(biāo)記抗體異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4、別藻藍(lán)蛋白（APC）-CXCR5和藻紅蛋白（PE）-PD-1常溫避光表面染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測CXCR5+PD-1+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。摘取小鼠腎臟，4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后行HE染色，按文獻(xiàn)［13］方法評估腎臟損傷情況。

2.體外Tfh細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞儀檢測：從上述對照組狼瘡鼠脾臟中分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選幼稚CD4+T細(xì)胞，分為3組進(jìn)行體外培養(yǎng)，空白對照組不做處理，誘導(dǎo)組加入10 μg/L IL-21、IL-6及3 μg/L抗CD3和CD28抗體培養(yǎng)5 d，干預(yù)組在誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上同時(shí)加入40 μmol/L黃芩苷體外培養(yǎng)5 d。用FITC-CD4、APC-CXCR5和PE-PD-1常溫避光表面染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測CXCR5+PD-1+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。用50 μg/L佛波酯、750 μg/L離子霉素和20 mg/L布雷非德菌素A刺激在上述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的部分幼稚CD4+T細(xì)胞5 h后，收集細(xì)胞，用FITC-CD4常溫避光表面染色20 min，重懸細(xì)胞于通透液，PE-IL-21染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測IL-21+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。

3.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。定量資料采用±s表示，通過方差分析和Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性水平α=0.05。

結(jié)果

一、黃芩苷治療狼瘡鼠狼瘡腎炎的療效

與對照組比較，黃芩苷腹腔注射治療4周能有效抑制狼瘡鼠腎臟炎癥細(xì)胞浸潤程度（圖1），黃芩苷組腎臟病理積分為3±0.82，對照組為5±0.82，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=2.828，P=0.018；兩組24h尿蛋白含量分別為（1 416±171）和（2 623±278）μg/24 h，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=6.204，P=0.022。

二、黃芩苷抑制狼瘡鼠體內(nèi)外Tfh分化

黃芩苷組狼瘡鼠脾臟重量（0.23±0.04）g，對照組（0.69±0.11）g，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=6.618，P=0.07。黃芩苷組狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例為12.6%±2.3%，對照組為40.2%±1.1%，兩組比較，t=14.9，P=0.005。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)干預(yù)組CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞和CD4+IL-21+細(xì)胞比例均低于誘導(dǎo)組（t值分別為2.64、18.03，P＜0.05或0.01）。見表1，圖2、3。

圖1 黃芩苷治療狼瘡鼠腎炎的療效（HE×40）1A：對照組；1B：黃芩苷組。黃芩苷組腎小球、腎小管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕

討論

糖皮質(zhì)激素是SLE目前的主要治療藥物，但長期使用可誘發(fā)一系列不良反應(yīng)。環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、他克莫司、嗎替麥考酚酯、雷公藤和生物制劑等免疫抑制劑也應(yīng)用于特定類型的SLE治療，但這些藥物常因價(jià)格昂貴或嚴(yán)重的不良反應(yīng)在臨床中的使用有限。因此尋找安全、有效且有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療藥物尤為重要。

SLE發(fā)病與自身抗體分泌增多、免疫復(fù)合物形成密切相關(guān)。Tfh細(xì)胞是一群輔助B細(xì)胞活化和促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體的重要細(xì)胞亞群［9］，主要存在于淋巴濾泡中。許多研究已經(jīng)證實(shí)，SLE患者外周血中存在多克隆Tfh細(xì)胞，且與SLE病情活動(dòng)和自身抗體分泌密切相關(guān)，因此Tfh細(xì)胞可作為SLE治療的有效靶點(diǎn)［2，9，14］，抑制Tfh細(xì)胞分化和功能可能進(jìn)一步阻止B細(xì)胞活化和自身抗體分泌。

黃芩苷是黃芩素的7-O-葡萄糖醛酸結(jié)合物，屬黃酮類化合物，既往研究提示，黃芩苷具有保肝、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用［15-16］。我們前期證實(shí)，黃芩苷可抑制Th17細(xì)胞，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增生，并可緩解關(guān)節(jié)炎癥損傷［17-18］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可有效降低狼瘡鼠24 h尿蛋白含量，緩解狼瘡鼠腎臟炎癥損傷，抑制狼瘡鼠脾臟增生，并有效抑制狼瘡鼠中Tfh細(xì)胞的增生。進(jìn)一步體外研究證實(shí)，黃芩苷可有效抑制Tfh細(xì)胞分化和IL-21產(chǎn)生，提示黃芩苷可能通過抑制Tfh細(xì)胞增生和效應(yīng)發(fā)揮治療狼瘡的作用。但是，黃芩苷是否通過氧化應(yīng)激途徑緩解狼瘡發(fā)病有待進(jìn)一步明確?？傊?，黃芩苷具有較明確的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，有希望應(yīng)用于SLE等自身免疫性疾病的治療。

表1 黃芩苷體外對狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化的影響（±s，%）

表1 黃芩苷體外對狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化的影響（±s，%）

組別空白對照組誘導(dǎo)組干預(yù)組F值P值只數(shù)4 4 4 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞1.8±0.5 17.6±0.9 13.3±0.8 2.64 0.04 CD4+IL-21+細(xì)胞0.2±0.1 2.7±0.2 1.0±0.4 18.03＜0.01

圖2 流式細(xì)胞儀檢測狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例黃芩苷組狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh比例低于對照組。PD-1：程序性死亡蛋白1；CXCR5：C-X-C趨化因子受體5

圖3 黃芩苷體外抑制狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化3A：40 μmol/L黃芩苷對CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞分化的影響；3B：40 μmol/L黃芩苷對CD4+IL-21+Tfh細(xì)胞分化的影響。PD-1：程序性死亡蛋白1；IL-21：白細(xì)胞介素21