楊 培，張 瑞，翟 陽，丁 潔，董文亮，劉玉紅,2*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2山東省中藥材良種選育工程技術(shù)研究中心，濟南 250355

北豆根為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC)的干燥根莖，有清熱解毒、祛風止痛之功效，常用于咽喉腫痛，熱毒瀉痢，風濕痹痛等證。北豆根中主要含生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等成分，目前對北豆根中的生物堿成分研究較多[1-3]，而對于北豆根多糖的研究鮮有報道。鑒于近些年中藥多糖廣泛生物活性的發(fā)現(xiàn)[4-7]，本文提取制備了北豆根粗多糖，研究了其對H2O2損傷PC12神經(jīng)細胞的作用，首次發(fā)現(xiàn)北豆根粗多糖具有較強的神經(jīng)保護活性，可用于神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病的治療。

由于北豆根多糖的提取過程中有大量蛋白質(zhì)的浸出，經(jīng)測量，蛋白質(zhì)的含量高達40%，為了獲得純化的多糖組分，本文選用酶法、Sevage法、酶-Sevage法、三氯乙酸(TCA)-正丁醇法、酶-TCA-正丁醇法去蛋白，以多糖保留率和蛋白脫除率兩個指標篩選出最佳除蛋白方法，并用響應(yīng)面法進行優(yōu)化，確定了北豆根多糖穩(wěn)定高效的除蛋白方法和工藝，為北豆根多糖的進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北豆根(產(chǎn)地山東，批號170501)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC)的干燥根莖。胰蛋白酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞(山東大學(xué))、胎牛血清(美國Hyclone公司)、DMEM(美國Gibco公司)、三氯乙酸、正丁醇、福林酚等均為分析純。

LGJ-18凍干機(北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司)、紫外分光光度計(安捷倫科技有限公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、酶標儀(美國Bio Tek Instruments)。

1.2 實驗方法

1.2.1 北豆根多糖的提取

稱取北豆根藥材500 g，加入20倍量水，90 ℃下提取120 min，共三次，提取液過濾，棄去沉淀。減壓濃縮，加入4倍量無水乙醇，4 ℃靜置過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得北豆根粗多糖。

1.2.2 北豆根多糖除蛋白方法比較

1.2.2.1 評價指標

采用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量：

多糖保留率=A1/A0

A1為除蛋白后北豆根粗多糖中所含的多糖的質(zhì)量，A0為除蛋白前粗多糖中所含的多糖的質(zhì)量。

采用福林酚法[9]測定蛋白質(zhì)含量：

蛋白清除率=(C0-C1) /C0

C1為除蛋白后北豆根粗多糖中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，C0為除蛋白前粗多糖中的蛋白質(zhì)質(zhì)量[10]。

綜合評分=0.5×(X/Xmax+Y/Ymax)×100

X為多糖保留率，Xmax為多糖保留率最大值，Y為蛋白清除率，Ymax為蛋白清除率最大值[11]。

1.2.2.2 胰蛋白酶法

取北豆根粗多糖500 mg，溶解并定容至50 mL，加入0.4 %胰蛋白酶。調(diào)pH7.8～8.5，37 ℃水浴攪拌6 h，期間不斷測pH，補加NaOH和水。攪拌完成后，調(diào)節(jié)pH至7.0，升溫至90 ℃并保持15 min，以滅活酶。將藥液冷卻至室溫，離心，收集上清液，冷凍干燥得去蛋白多糖，稱重，并測量多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.3 Sevage法

取北豆根粗多糖5份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號1、2、3、4、5，加入1/5的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，振搖20 min，靜置5 min，離心并收集上清液，5份樣品分別重復(fù)上述操作1、2、3、4、5次，真空濃縮揮去溶劑，凍干并稱重，分別測量多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.4 酶-Sevage法

取北豆根粗多糖5份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號1、2、3、4、5，先依據(jù)1.2.2.2中的酶法進行除蛋白，再用1.2.2.3項下的Sevage法除蛋白，分別重復(fù)1、2、3、4、5次，真空濃縮揮去溶劑，凍干并稱重，分別測多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.5 TCA-正丁醇法

取北豆根粗多糖2份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號1、2，分別加入2倍量TCA-正丁醇溶液(20%TCA∶正丁醇=1∶10)，振搖20 min，4 ℃放置1 h，靜置取下層，2號重復(fù)2次，真空揮去溶劑，凍干并稱重，測得多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.6 酶-TCA-正丁醇法

取北豆根粗多糖2份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號1、2，先用1.2.2.2項下的胰蛋白酶法除蛋白，再依據(jù)1.2.2.5項下的TCA-正丁醇法進行除蛋白，分別重復(fù)1、2次，稱重并測量多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白

選取三個對TCA-正丁醇法除蛋白效果影響較大的因素TCA 與正丁醇體積比(A)，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比(B)，振搖時間(C)為考查因素，根據(jù)Box-Behnken中心實驗設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)值為中心點，上下各選一個水平值作為響應(yīng)面實驗設(shè)計水平，以多糖保留率和蛋白脫除率計算所得的綜合評分為指標，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析(見表1)。采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平表

1.2.4 北豆根粗多糖對 H2O2誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞損傷的保護作用

收集對數(shù)期的 PC12細胞，調(diào)整濃度為10×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。待細胞融合后，加入不同濃度的經(jīng)上述優(yōu)化工藝除蛋白后的北豆根多糖溶液100 μL，另設(shè)對照組和模型組[12-15]，均加入100 μL含2%血清的DMEM培養(yǎng)基。作用24 h后，除對照組外，其余各孔加入用培養(yǎng)基稀釋的0.75 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，然后每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。仔細吸去上清，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(測定波長為570 nm)，按照下面公式計算細胞存活率：存活率(%)=(實驗組A570/對照組A570)×100%[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同除蛋白方法考查結(jié)果

2.1.1 酶法

酶法除蛋白是利用蛋白酶降解多糖中的蛋白質(zhì)使其分解成小肽，處于較好的水溶性狀態(tài)，通過醇沉從而與多糖分離開來。酶法除蛋白后計算多糖保留率為59.82%，蛋白清除率為62.21%，由結(jié)果可以得出，酶法除蛋白雖然蛋白清除率較高，但是多糖損失較多。

2.1.2 Sevage法

Sevage法是多糖除蛋白較為常用的方法，該實驗考查了用Sevage法除北豆根多糖中蛋白1-5次的效果，結(jié)果見圖1。隨著除蛋白次數(shù)的增多，蛋白脫除率逐漸增加，但多糖保留率也逐漸下降，第4次以后多糖保留率下降幅度明顯增加。因此，Sevage法除蛋白4次效果最佳，此時多糖保留率66.6%，蛋白清除率38.33%，

圖1 Sevage法除蛋白結(jié)果Fig.1 The results of Sevage method to remove protein

2.1.3 酶-Sevage法

酶法結(jié)合Sevage法除蛋白效果較Sevage法更好，蛋白脫除率更高，結(jié)果見圖2。隨著除蛋白次數(shù)的增多，蛋白脫除率逐漸增加，但多糖保留率也逐漸下降，當除蛋白次數(shù)為3次時，多糖保留率為57.31%，蛋白脫除率為60.27%，為酶-Sevage法最佳除蛋白次數(shù)。

2.1.4 TCA-正丁醇法

TCA-正丁醇法也是多糖除蛋白較常用的一種方法，該方法效率較Sevage法高，一般只需操作一次即可，該實驗比較了TCA-正丁醇法除蛋白1次和2次的效果，結(jié)果如圖3。由圖可知，該實驗操作重復(fù)兩次后，雖然蛋白脫除率增大了，但是多糖保留率也出現(xiàn)了大幅度的下降。因此TCA-正丁醇法除蛋白重復(fù)1次即可，此時的多糖保留率為82.4%，蛋白清除率為53.88%。

圖2 酶-Sevage法除蛋白結(jié)果Fig.2 The results of enzyme-Sevage method to remove protein

圖3 TCA-正丁醇除蛋白結(jié)果Fig.3 The results of TCA-n-butanol method to remove protein

2.1.5 酶-TCA-正丁醇法

結(jié)合酶法和TCA-正丁醇法對北豆根多糖除蛋白效果如圖4。由圖可知，該實驗操作重復(fù)兩次后，雖然蛋白脫除率增大了，但是多糖保留率非常低。因此酶-TCA-正丁醇法除蛋白重復(fù)1次即可，此時的多糖保留率為48.82%，蛋白清除率為79.62%。

2.1.6 不同除蛋白方法考查結(jié)果

按照上述確定的條件對5種除蛋白方法進行比較，每種方法重復(fù)3次，結(jié)果見圖5，5種除蛋白的方法對北豆根多糖都有一定的脫蛋白效果，但是同時也會造成一定的多糖損失。從脫蛋白的效果來看，除了Sevage法蛋白清除率較低，其他四個方法的蛋白脫除率都還可以，酶-TCA-正丁醇法的蛋白脫除率最高，達到79.62%。而從多糖保留率來看，TCA-正丁醇法的多糖保留率最高。綜合考慮，北豆根多糖除蛋白以TCA-正丁醇法為宜。

圖4 酶-TCA-正丁醇除蛋白結(jié)果Fig.4 The results of enzyme-TCA-n-butanol method to remove protein

圖5 不同除蛋白方法結(jié)果比較Fig.5 Comparison of different protein removal methods

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

采用 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，用自變量 A、B、C 表示TCA 與正丁醇體積比、北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比、振搖時間三個影響因素，以綜合評分為響應(yīng)值(Y)。利用 Design Expert 8.06軟件對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，得到回歸模型參數(shù)和方差分析，其結(jié)果見表 2和表 3。

利用Design-Expert 8.06b軟件對TCA 與正丁醇體積比(A)、北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比(B)、振搖時間(C)三個因素對北豆根多糖除蛋白綜合評分(Y)進行響應(yīng)面分析，建立三元二次回歸方程：Y=91.32+0.64A-1.05B+2.57C-1.65AB-0.59AC-1.77BC-4.02A2-5.20B2-2.25C2。由表3的方差分析可以看出，該回歸模型P<0.05，說明回歸模型達到顯著水平，失擬項P=0.476 0>0.05，差異不顯著，表明該未知因素對試驗結(jié)果干擾較小，殘差均由隨機誤差所引起。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.930 7，說明該模型擬合度較好，實驗誤差較小。從 F值可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，振搖時間對多糖得率的影響最大，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比的影響次之，TCA 與正丁醇體積比的影響最小。交互項AB、AC、BC對試驗結(jié)果影響不顯著(P>0.05)；一次項C，二次項A2對試驗結(jié)果影響顯著(P<0.05)，二次項B2對試驗結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，說明各工藝條件與北豆根多糖除蛋白的綜合評分之間不是簡單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。綜上所述，該模型擬合度高，可用該回歸模型來描述各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，因此可用該模型預(yù)測北豆根多糖用TCA-正丁醇法除蛋白的工藝條件。

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 基于綜合評分的回歸模型方差分析

續(xù)表2(Continued Tab.2)

方差來源Source離差平方和Square sum自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value顯著度SignificanceBC12.53112.532.020.198 4A267.99167.9910.950.013 0?B2113.681113.6818.300.003 7??C221.33121.333.440.106 2殘差Residual43.4776.21失擬度Lack of Fit18.7236.241.010.476 0絕對誤差Pure Error24.1546.19總離差Cor Total357.0216

注:*P<0.05，顯著；**P<0.01，極顯著。

Note:*P<0.05 Significant different；**P<0..01 extremely Significant different.

圖6 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of TCA-n-butanol method removing protein by Response Surface Method

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

通過響應(yīng)面3D圖能直接觀察因素交互作用對綜合評分的影響。如果響應(yīng)面圖曲線越陡，顯示綜合評分受該因素影響越大；反之，曲線越緩，表明綜合評分受該因素影響越小。影響北豆根多糖提取的各因子交互效應(yīng)的強弱則能通過等高線形狀體現(xiàn)出來。圓形狀等高線表示交互作用不顯著，而橢圓形等高線表示交互作用顯著。響應(yīng)面優(yōu)化具體結(jié)果見圖6。由圖可知，振搖時間對多糖得率的影響最大，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比的影響次之，TCA 與正丁醇體積比的影響最小且三個因素之間的交互作用不明顯。通過對回歸模型求解方程，得出北豆根多糖的最佳提取工藝條件為TCA∶正丁醇=1∶10.4，北豆根多糖溶液∶ TCA-正丁醇溶液=1∶1.77，振搖時間為36.5 min。此條件下北豆根多糖除蛋白的綜合評分的理論值為92.3。

2.2.3 驗證實驗

為檢驗實驗?zāi)Ｐ偷目煽啃?，采用上述工藝條件進行北豆根多糖的除蛋白實驗，同時考慮到實際操作的可行性，將實驗條件定為∶TCA∶正丁醇=1∶10.4，北豆根多糖溶液∶TCA-正丁醇溶液=1∶1.77，振搖時間為36.5 min，在此條件下，北豆根多糖的多糖保留率為62.9%，蛋白清除率為73.1%，綜合評分為92.1，與理論值相比相對誤差為0.16%。因此，基于單因素試驗的響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，方法可行可靠，具有實用價值。

2.3 北豆根粗多糖的神經(jīng)保護活性

北豆根粗多糖的神經(jīng)保護活性結(jié)果見圖7，空白對照組的細胞存活率為100%，而陰性對照組只加入H2O2損傷細胞4 h可明顯引起細胞的損傷，其細胞存活率為45.6%。加入不同濃度的北豆根粗多糖溶液后，細胞存活率都有不同程度的增加，北豆根粗提液中多糖濃度為50 μg/mL時，細胞存活率為52.7%；多糖濃度為100 μg/mL時，細胞存活率為58.5%，與模型組比較具有顯著性意義(P<0.05)。而當北豆根粗提液中多糖濃度為200 μg/mL時，細胞存活率達到97.1%，與模型組比較具有極顯著性意義(P<0.01)。這說明北豆根多糖粗提物可以對H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細胞損傷起到一定的保護作用。

3 討論

多糖主要以兩種形式存在，一種是純糖鏈，另一種是糖鏈和肽鏈結(jié)合，形成糖肽和糖蛋白。在多糖的研究中，蛋白質(zhì)的存在會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，在北豆根多糖的生物活性、藥用效果研究中，多糖的純化是首要和關(guān)鍵的步驟，多糖純度的高低直接影響后續(xù)的藥理活性、結(jié)構(gòu)分析及構(gòu)效關(guān)系研究的準確性。實驗室中常用的除蛋白方法有酶法、酶-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法等，這些方法在除蛋白的同時，也會對多糖造成一定的損失。本實驗綜合了這幾種方法的多糖保留率和蛋白清除率兩個指標，篩選出北豆根多糖除蛋白的最佳方法并通過優(yōu)化得到了最佳工藝，為后續(xù)北豆根多糖的研究奠定基礎(chǔ)。

圖7 北豆根多糖對H2O2損傷的PC12細胞的保護作用Fig.7 The protective effect of Rhizoma Menispermi polysaccharide on H2O2-induced PC12 cell injury注：與模型組比較：*P<0.05 顯著；**P<0.01 極顯著。Note:Compared with the model group :*P<0.05 Significant different；**P<0.01 extremely Significant different.

北豆根具有清熱解毒、祛風止痛的功效，北豆根中主要的活性成分是生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗高血壓、抗心律失常等作用。本實驗首次發(fā)現(xiàn)北豆根多糖粗提液具有神經(jīng)保護作用。H2O2是產(chǎn)生活性氧成分的化學(xué)物質(zhì)，許多神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機制均與H2O2有關(guān)，常用作神經(jīng)細胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑，經(jīng)篩選得出濃度為0.75 μmol/L的H2O2作用于PC12細胞4 h可使細胞損傷50%左右。經(jīng)查閱文獻，該實驗設(shè)置了空白對照組、模型組及藥物組，結(jié)果表明，當加入不同濃度的北豆根粗多糖溶液后，經(jīng)H2O2損傷的細胞存活率顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此，北豆根粗多糖溶液對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷具有一定的保護作用。由于北豆根多糖粗提液中多糖含量較低，后續(xù)我們會對北豆根多糖進行分離純化，進而研究北豆根多糖神經(jīng)保護作用機制。本文研究為北豆根多糖進一步應(yīng)用于氧化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的治療提供一定的實驗依據(jù)。