連紫宛，李占強(qiáng)，張海燕，劉瑞欣 ，陳辛玲 ，王 剛*

1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心；3青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4青海省第五人民醫(yī)院，西寧 810000

雪靈芝(Arenariakansuensis)為生長在海拔3 500～5 300米礫石帶的石竹科無心菜屬墊狀草本植物，其藏藥名為阿仲嘎布，《藏藥志》中稱其“以全草入藥，其性味苦寒，有清熱、利肺、止咳、散腫等功效”，藏族民間用其水煮液進(jìn)行藥浴治療關(guān)節(jié)炎[1,2]。近年來，隨著高原植物藥學(xué)研究的日益深入，有關(guān)雪靈芝的藥用價(jià)值也逐漸被國內(nèi)研究者重視。在藥化研究方面，雪靈芝含有多糖、三萜皂苷、黃酮、生物堿等活性物質(zhì)；在藥效研究方面，雪靈芝提取物具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等相關(guān)研究也見諸于報(bào)道[3]。本課題組前期開展的體內(nèi)外研究，分別從水溶性提取物、粗多糖層次，證實(shí)了雪靈芝具有激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子水平的生物活性[4-8]，而對(duì)雪靈芝多糖進(jìn)行純化并追蹤其免疫激活活性的研究尚未見報(bào)道。本研究采用柱色譜分離法、GPC-RI-MALS法和HPLC法對(duì)雪靈芝多糖進(jìn)行分離純化、測(cè)定純化組分的分子量和單糖組成，并觀察不同分離純化階段的雪靈芝多糖對(duì)體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞增殖、腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠,共12只，雌雄各半，4～6周齡，體重20±2 g，購自青海省地方病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK青2012-001。

1.2 主要試劑與儀器

甘肅雪靈芝全草購自青海九康醫(yī)藥保健品有限公司，由中國科學(xué)院西北高原生物研究所劉增根副研究員鑒定為甘肅雪靈芝(ArenariakansuensisMaxim)。DEAE Cellulose 52柱(北京Solarbio科技有限公司)，Sephadex G-75柱(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，半乳糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖(上海源葉生物科技有限公司)，木糖、阿拉伯糖(長春市安譜生物科技有限公司)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購自山東西亞化學(xué)股份有限公司，NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠 IFN-γ ELISA試劑盒(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。

高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)，自動(dòng)部分收集器(上海嘉鵬科技有限公司)，冷凍干燥機(jī)(德國Christ 公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，18角度激光光散射凝膠滲透色譜儀(美國懷雅特公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Forma 公司)， 96孔板離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(日本Bio-rad公司)。

1.2 雪靈芝多糖的提取及分離純化

1.2.1 雪靈芝粗多糖的提取

參照文獻(xiàn)[4]，采用水提醇沉法提取雪靈芝粗多糖。

1.2.2 雪靈芝多糖分離純化

1.2.2.1 DEAE Cellulose 52 離子交換柱層析

配制10 mg/mL的雪靈芝粗多糖水溶液，充分溶解后4 000 rpm離心10 min，取上清沿柱壁緩慢加入2.5 cm×45 cm 的DEAE -52纖維素層析柱，按流速2 mL/min，以蒸餾水、0.1、0.15、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。苯酚-硫酸法于490 nm檢測(cè)波長下隔管檢測(cè)多糖吸光度，直到無多糖組分流出。以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。收集濃縮同一峰洗脫液，濃縮，脫鹽，凍干，獲得AKP-1～5共五個(gè)多糖組分。

1.2.2.2 Sephadex G-75凝膠柱層析

取AKP-2多糖樣品0.2 g溶于60 mL去離子水中，充分溶解后，4 000 rpm離心10 min，取上清加至42 cm×100 cm 的Sephadex G-75凝膠柱，設(shè)置流速為0.5 mL/min，以蒸餾水進(jìn)行洗脫，以5 mL/管自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，期間進(jìn)行苯酚硫酸法檢測(cè)，直至無多糖流出。以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。收集濃縮同一峰洗脫液、冷凍干燥，得到AKP-2a多糖組分。

1.3 苯酚-硫酸法檢測(cè)雪靈芝多糖的總糖含量

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制為1 mg/mL濃度，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品液0.4、0.6、0.8、1.2、1.8 mL，以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，設(shè)2.0 mL蒸餾水為空白對(duì)照。各管加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻后40 ℃水浴15 min，室溫下靜置30 min，于490 nm處測(cè)吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 雪靈芝多糖總糖含量測(cè)定

配制0.5 mg/mL濃度的不同純化階段的多糖樣品溶液2 mL，按上步驟操作，在490 nm波長處測(cè)吸光度值，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品總糖含量。

1.4 雪靈芝多糖AKP-2a分子量測(cè)定

采用凝膠滲透色譜-十八角激光光散射(GPC-MALS)法測(cè)定AKP-2a多糖的分子量。液相色譜條件：色譜柱為ShodexOHpak SB-806HQ/804HQ；流動(dòng)相：超純水(0.02%疊氮鈉)，PH=6 ；流速：1.0 mL/min；柱溫為 25 ℃；進(jìn)樣量為 100 μL。樣品溶液的處理：稱取2 mg AKP-2a多糖樣品，加流動(dòng)相1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后，進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 AKP-2a單糖組分測(cè)定

1.5.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)混合液和AKP-2a水解樣品的制備

稱取10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg分別定容至1 mL，將其等體積混合配成濃度為1 mg/mL 的單糖標(biāo)準(zhǔn)品液；稱取10 mg AKP-2a樣品，加入4 mol/L TFA(三氟乙酸)0.5 mL，在120 ℃條件下水解2 h，氮?dú)獯蹈桑?00 μL去離子水溶解樣品，0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.5.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和AKP-2a水解樣品衍生化

取雪靈芝多糖AKP-2a水解液和單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液各200 μL，分別加入0.3 mol/L NaOH溶液500 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液500 μL，混勻后70 ℃水浴60 min，冷卻至室溫，加0.3 mol/L HCl溶液500 μL，搖勻后加500 μL氯仿，振蕩搖勻后靜置20 min，棄氯仿層，重復(fù)3次，水層過0.45 μm微孔濾膜備用。

1.5.3 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度梯度分別為13.33、10.00、6.67、5.00、2.67 μg/mL的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，色譜條件：色譜柱SHISEIDO C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)-乙腈(v/v=82∶18)；流速:1 mL/min；檢測(cè)波長:245 nm；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫:25 ℃。按照單糖濃度與峰面積建立回歸方程。

1.5.4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和AKP-2a樣品HPLC 檢測(cè)

將衍生化處理的單糖標(biāo)準(zhǔn)品和AKP-2a樣品，按1.5.3的方法進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。

1.6 雪靈芝多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

1.6.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備

實(shí)驗(yàn)小鼠7只，參照文獻(xiàn)[4]制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。

1.6.2 MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖

小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液(2×106/mL)按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。設(shè)置空白對(duì)照組、香菇多糖(終濃度為5 μg/mL)陽性對(duì)照組、以及不同純化階段的雪靈芝多糖的低、中、高(終濃度為分別為50、100、200 μg/mL)處理組，每個(gè)樣本設(shè)3復(fù)孔對(duì)照孔及3復(fù)孔刺激孔，除空白孔加入100 μL培養(yǎng)液，其余各孔分別加入100 μL培養(yǎng)液溶解的藥物。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱44 h后，各孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將96孔板置于平板離心機(jī)，2 000 rpm離心5 min，將上清180 μL吸棄，每孔加150 μL DMSO，振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長處的吸光度。結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示：SI=刺激孔OD值/對(duì)照孔OD值。

1.7 雪靈芝多糖AKP-2a對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

1.7.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液制備及分組

實(shí)驗(yàn)小鼠5只，參照文獻(xiàn)[4]制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液(1×105/mL)按 180 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h 后吸棄上層培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組，脂多糖(終濃度為5 μg/mL)陽性對(duì)照組， AKP-2a 低、中、高(終濃度為分別為25、50、100 μg/mL)處理組，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除空白孔加入20 μL培養(yǎng)液，其余各孔分別加入20 μL培養(yǎng)液溶解的藥物，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。

1.7.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放水平檢測(cè)

吸取培養(yǎng)上清，按NO一步法試劑盒說明書操作，檢測(cè)NO釋放水平。

1.7.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IFN-γ水平檢測(cè)

吸取培養(yǎng)上清，按雙抗體夾心法ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)IFN-γ水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雪靈芝多糖提取與分離純化

2.1.1 雪靈芝粗多糖提取

雪靈芝干粉8 kg經(jīng)水提醇沉法，Sevage法脫蛋白后，共獲得61.8 g雪靈芝粗多糖，經(jīng)計(jì)算得率為0.77%。

2.1.2 雪靈芝多糖DEAE Cellulose 52離子交換柱層析

雪靈芝粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析，獲得中性多糖AKP-1和酸性多糖AKP-2、AKP-3、AKP-4、AKP-5(見圖1)。

圖1 DEAE-52纖維素NaCl溶液梯度洗脫曲線Fig.1 NaCl gradient elution curve with DEAE-52 cellulose column

2.1.3 Sephadex G-75凝膠柱層析

將AKP-2進(jìn)行Sephadex G-75凝膠柱層析，得到單一峰的AKP-2a多糖組分(見圖2)。

圖2 AKP-2a Sephadex G-75 洗脫曲線Fig.2 Elution curve of AKP-2a on Sephadex G-75 column

圖3 AKP-2a的GPC-MALS分析Fig.3 GPC-MALS analysis of AKP-2a

2.2 不同純化階段雪靈芝多糖的總糖含量測(cè)定

以苯酚-硫酸法，測(cè)得雪靈芝粗多糖AKCP的總糖含量為52%，雪靈芝多糖AKP-2的總糖含量為70%，雪靈芝多糖AKP-2a的總糖含量為79%。

2.3 雪靈芝多糖AKP-2a分子量測(cè)定

AKP-2a經(jīng)GPC-MALS檢測(cè)，AKP-2a重均分子量Mw為2.07×105Da，數(shù)均分子量Mn為9.838× 104Da，分散系數(shù)(Mw/Mn)為2.104(見圖3)。

2.4 雪靈芝多糖AKP-2a單糖組成分析

對(duì)濃度梯度單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，按各單糖對(duì)應(yīng)的峰面積建立回歸方程，結(jié)果在2.67～13.33 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(見表1)；混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品與AKP-2a的HPLC色譜分析見圖4；AKP-2a單糖組成為半乳糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及巖藻糖(見表2)。其摩爾比為：1∶0.25∶0.01∶0.20∶0.11∶0.25∶0.61∶0.07∶0.21∶0.12。

圖4 10種混合單糖對(duì)照品(a)，AKP-2a(b)的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of 10 mixed standard monosaccharides (a) and AKP-2a (b)注：1.甘露糖2.核糖3.鼠李糖4.葡萄糖醛酸5.半乳糖醛酸6.葡萄糖7.半乳糖8.木糖9.阿拉伯糖10.巖藻糖。Note:1.Mannose 2.Ribose 3.Rhamnose 4.Glucturonic acid 5.Galacturonic acid 6.Glucose 7.Galactose 8.Xylose 9.Arabinose 10.Fucose.

2.5 AKCP 、AKP-2、AKP-2a對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響

MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖，結(jié)果顯示，香菇多糖組、AKCP、AKP-2、AKP-2a各濃度組SI均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，其中以AKP-2a高劑量組刺激作用最為明顯，高于香菇多糖組及其它各藥物濃度組(P<0.05),(見圖5)。

2.6 AKP-2a對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

經(jīng)NO釋放實(shí)驗(yàn)及ELISA檢測(cè)，脂多糖組、AKP-2a各濃度組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO水平、IFN-γ水平，均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，(見表3)。

表1 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 AKP-2a單糖含量測(cè)定

表3 AKP-2a對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

注:與空白對(duì)照組比較，*P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.01.

圖5 AKCP、AKP-2、AKP-2a 對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平的影響Fig.5 Effects of AKCP、AKP-2、AKP-2a on the level of lymphocyte proliferation in vitro 注:與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與香菇多糖組、AKCP和AKP-2高、中、低濃度組、AKP-2a中、低濃度組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with LNT,AKCP-H,AKCP-M,AKCP-L,AKP-2-H,AKP-2-M,AKP-2-L,AKP-2a-M,AKP-2a-L,#P<0.05.

3 結(jié)論

目前，植物來源多糖分離純化及免疫活性研究日益廣泛[9-11]，而有關(guān)雪靈芝多糖的分離、純化及活性研究方面報(bào)道較少。國內(nèi)彭光華等[12]對(duì)西藏來源的雪靈芝提取粗多糖，采用DEAE-52離子交換柱進(jìn)行色譜分離獲得5個(gè)多糖組分，其中蒸餾水洗脫的的第1峰和0.13 M·L-1NaCl洗脫的第4峰組分，經(jīng)2次葡聚糖凝膠G-75柱分離，獲得單一對(duì)稱峰的MAP1和MAP4組分；通過氣相色譜法分析這2個(gè)組分中的6種單糖組成，結(jié)果顯示以甘露糖、葡萄糖、半乳糖含量較高。

本研究選擇青海分布最廣、資源量最大的甘肅雪靈芝為原料，水提醇沉法提取雪靈芝粗多糖，經(jīng)去除蛋白、色素后，采用DEAE-52纖維素柱色譜分離到1個(gè)中性和4個(gè)酸性多糖組分(AKP-1～AKP-5)然而這5個(gè)多糖組分在洗脫的鹽濃度梯度、各峰高度及峰面積方面，與彭光華等人的色譜圖有所差異。另外，本研究選擇0.1 mol/L NaCl洗脫的第2峰多糖組分(AKP-2)經(jīng)過1次葡聚糖凝膠G-75柱色譜分離，獲得單一峰AKP-2a組分。經(jīng)高效液相色譜法分析10種單糖組成，顯示AKP-2a以半乳糖糖醛酸含量最高，其次分別為半乳糖、葡萄糖及甘露糖。以上差異，提示不同地區(qū)分布的野生雪靈芝種類、種群間多糖的組成可能存在差異，而且不同鹽濃度梯度洗脫組分的單糖組成有所不同。本研究通過DEAE-52纖維素柱層析、葡聚糖凝膠G-15柱脫鹽及葡聚糖凝膠G-75柱層析，使雪靈芝多糖的總糖含量從粗多糖AKCP的52%，逐步提高到AKP-2的70%以及AKP-2a的79%，表明上述方法可有效分離純化雪靈芝多糖。

脾淋巴細(xì)胞增殖是適應(yīng)性免疫激活的重要環(huán)節(jié)[13,14]。本研究結(jié)果顯示，在50～200 μg/mL濃度范圍，AKCP 、AKP-2、AKP-2a均顯示出濃度依賴性的促進(jìn)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的活性，其中以AKP-2a高濃度組最為明顯。巨噬細(xì)胞是固有性免疫的重要組成，IFN-γ表達(dá)及NO釋放水平，是其活化的主要標(biāo)志。本研究結(jié)果，在25～100 μg/mL濃度范圍，AKP-2a對(duì)于體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中二者的表達(dá)，顯示出顯著的濃度依賴性刺激作用，與我們之前的研究結(jié)果[3]相比，顯示出對(duì)巨噬細(xì)胞更強(qiáng)的激活作用。即AKP-2a 在100 μg/mL 濃度下達(dá)到的激活效應(yīng)，與粗多糖在200 μg/mL濃度下達(dá)到的激活效應(yīng)相當(dāng)。上述結(jié)果提示，本研究通過分離純化所獲得的雪靈芝多糖AKP-2a，保持了對(duì)適應(yīng)性、固有性免疫細(xì)胞的激活作用并有所增強(qiáng)。這為今后進(jìn)一步開展雪靈芝多糖的分子結(jié)構(gòu)及免疫激活機(jī)制方面的研究打下了一定基礎(chǔ)。