李 雙，楊曉涵，李懷宇，陳麗玲，劉艷紅，王華晶，秦華炎，陳 彤*

1昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500；2四川省涼山州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 涼山 615000；3大理護理職業(yè)學(xué)院，大理 671006；4昆明醫(yī)科大學(xué)臨床技能中心，昆明 650500

三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen為五加科人參屬植物，是我國珍貴的中藥材[1]。道地產(chǎn)地是云南文山。三七的有效成分包括皂苷、三七素、黃酮、聚炔醇、多糖、脂肪酸以及環(huán)肽類等[2]。但目前對三七有效成分的研究利用主要集中在皂苷成分[3,4]。每年用于提取三七總皂苷的三七約為1400噸，三七總皂苷的工業(yè)提取工藝：取三七碎成粗粉，用70%的乙醇提取，濾過[1]。三七總皂苷提取后，目前大多藥企把提取過三七總皂苷的三七藥渣請環(huán)保單位當(dāng)成廢渣處理，少數(shù)企業(yè)將三七藥渣壓成板用作生物燃料，這對名貴中藥三七是一種浪費。

日本學(xué)者小菅卓夫等[5]首次從三七根中分離并鑒定了三七的主要止血活性成分是一種特殊的水溶性非蛋白質(zhì)氨基氨基酸即三七素，化學(xué)名為β-草氨酸-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diamino-propionic acid，簡稱β-ODAP)，分子式為C5H8N2O5，相對分子質(zhì)量為176.13。參照有關(guān)文獻報道，目前對于分離三七素主要采用柱色譜的方法，魯岐等[6]采用Sephadex LH-20凝膠柱和CM Sephadex C-25凝膠離子交換柱，謝國祥[7]等用001×7陽離子交換樹脂柱，賈偉[8]等用D001型離子交換樹脂柱，譚朝陽[9]等用732強酸型陽離子交換樹脂和CM Sephadex C-25凝膠離子交換柱，但上述三七素均是從三七中提取純化得到。

圖1 三七素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of dencichine

本課題以提取過三七總皂苷的工業(yè)三七藥渣為原料，考察工業(yè)三七藥渣中是否含有三七素并進行分離純化，測定三七素供試品的含量，考察三七素供試品的止血藥理活性。本課題有利于三七資源的綜合利用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030型HPLC色譜儀(日本島津)，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，LabconcoR4.5L冷凍干燥機(美國Labconco公司)，BSA224S型萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，TDZ4臺式低速離心機(湖南郝西儀器裝備有限公司)，5210HP型超聲波清洗機(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)。

1.2 試藥

工業(yè)三七藥渣(云南云科藥業(yè)有限公司提供)，001×7陽離子交換樹脂(艾美科健生物醫(yī)藥有限公司)，硅膠板(青島海洋化工廠)，三七素標(biāo)準(zhǔn)品(上海純優(yōu)生物科技，純度>98%)，茚三酮、氯化鈉、無水乙醇、冰醋酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，氨水(成都市科龍化工試劑廠)，正丁醇(西隴化工有限公司)，丙酮(重慶川東化工有限公司)，甲醇，乙腈均為色譜純，0.9%生理鹽水，酚磺乙胺注射液(天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，2 mL:0.5 g)。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠(購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(滇)K2015-0002)，雌性，6周齡，體重20±2 g，25只。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七素的提取

取工業(yè)三七藥渣1 kg，加6倍量重量的蒸餾水在50 ℃的恒溫水浴鍋中浸提8 h，收集濾液，濾渣加3倍量重量的蒸餾水提取8 h，收集濾液，合并兩次濾液。以4 500 rpm，離心5 min，傾倒上清液，抽濾，得濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/9，加入3倍量乙醇，邊加邊攪拌，4 ℃下靜置24 h，抽濾；將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50 ℃回收乙醇，得粗提液約100 mL。

2.2 三七素的分離與純化

2.2.1 001×7陽離子交換樹脂純化三七素

取粗提液30 mL，經(jīng)001 × 7陽離子交換樹脂柱純化(3 cm × 30 cm)，流速為0.2 mL/min，先用水洗脫，以除去色素等雜質(zhì)，至洗脫液為無色；再用0.1 mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，每管10 mL，茚三酮顯色，至洗脫液不顯紫色，結(jié)束洗脫。

2.2.2 三七素的薄層鑒別(確證三七藥渣中是否含有三七素)

將顯色的各管洗脫液與三七素對照品各10 μL在硅膠板上點樣，展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶乙醇∶水( 4∶1∶1∶2 )，茚三酮溶液為顯色劑(110 ℃ 顯色5 min)，觀察是否有與三七素對照品相同Rf值及顏色的斑點。

2.2.3 丙酮結(jié)晶

合并與三七素對照品斑點有相同Rf值及顏色且只有這一個斑點的洗脫液。合并液于50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加適量水使其全部溶解，倒至燒杯中，加入30倍量的丙酮，邊加邊攪拌，析出大量沉淀，過0.2 μm濾膜，沉淀用少量水溶解；所得水溶液繼續(xù)用同樣的方法再次結(jié)晶；將重結(jié)晶溶于水，進行薄層檢測驗證，結(jié)果僅有一個斑點且與三七素對照品有相同Rf值和顏色，將重結(jié)晶水溶液冷凍干燥，得三七素供試品，備用。

2.3 三七素供試品的含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 (250 mm × 4.6 mm，5 μm )；流動相：溶劑A∶溶劑B(95∶5，v∶v)，溶劑A為0.001 %的醋酸溶液，溶劑B為乙腈∶甲醇∶水(45∶10∶45,v∶v∶v)的混合溶液；流速1.0 mL/min，檢測波長：214 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。

圖2 三七素色譜圖Fig.2 Chromatogram of dencichin注：A：三七素標(biāo)準(zhǔn)品；B：三七素供試品。Note:A:Standard of dencichine;B:Test product dencichine.

因三七素水溶性好，反相高效液相出峰時間短，三七素粗提物、樹脂純化和結(jié)晶各階段高效液相色譜圖見圖3：各階段高效液相色譜證實了工業(yè)三七藥渣中含有三七素，并證實三七素在分離純化的各個步驟中存在。

圖3 三七素色譜圖Fig.3 Chromatogram of dencichin注：A：三七素標(biāo)準(zhǔn)品；B：三七素粗提液；C：樹脂柱層析后溶液；D：三七素供試品。Note:A:Standard of dencichine;B:Crude decichine extract;C:Dencichine solution obtained by chromatograohy separation with cation exchange resin;D:Test product dencichine.

2.3.2 對照品溶液的配制

精密稱取三七素對照品2.5 mg，置25 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。臨用前用0.2 μm微孔濾膜過濾。

2.3.3 供試品溶液的配制

精密稱取供試品2.5 mg，置25 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。臨用前用0.2 μm微孔濾膜過濾。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品儲備液適量，用流動相配制成濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的對照品溶液，搖勻，依次進樣，按上述色譜條件測定，以三七素對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸。得回歸方程A=1 867.6C-24 814，r2=0.999 26，結(jié)果表明三七素對照品濃度在20～100 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 儀器精密度試驗

精密吸取濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，按照2.3.1中色譜條件進樣，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，峰面積依次為167 461、170 647、168 729、170 984、166 467、169 710，RSD為1.06%，結(jié)果表明，用于本品的檢測儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號供試品6份，按照2.3.3中“供試品溶液的制備”方法操作，制備6份供試品溶液，分別進樣，記錄峰面積，峰面積依次為96 412、97 984、95 118、97 555、96 098、96 275，RSD為1.08%，結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣測定，記錄峰面積，峰面積依次為96 424、95 984、96 118、97 357、96 288、96 325。RSD為0.51%，結(jié)果表明，本供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗

精密量取待測樣品6份，按照2.3.3中“供試品溶液的制備”方法操作，分別加入三七素對照品(對照品濃度為0.1 mg/mL)0.4 mL，即加入0.04 mg三七素，進樣，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果表明，本方法加樣回收率良好。

表1 三七素供試品加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.9 含量測定

稱取供試品2.5 mg，按照3.3.3中供試品溶液的制備供試液3份，進樣20 μL，計算三七素的含量。

表2 三七素供試品中三七素的含量測定結(jié)果(n=3)

2.4 三七素供試品的凝血實驗

2.4.1 玻片法測定凝血時間

取昆明種小鼠25只，隨機分為5組，每組5只，分別用苦味酸標(biāo)記。組別分別為生理鹽水組(陰性對照組)、酚磺乙胺注射液組(陽性對照組，25 mg/mL)、三七素粗提液注射液組(27 mg/mL)、三七氨基酸注射液組(9.4 mg/mL)、三七素粗品低濃度組(1.6 mg/mL)、三七素粗品中濃度組(3.2 mg/mL)、三七素粗品高濃度組(6.4 mg/mL)。腹腔注射給藥，劑量為10 mL/kg。30 min后用眼科彎鑷迅速摘去小鼠一側(cè)眼球，即有血液流出。將血滴至干凈的載玻片上，血滴直徑約為5 mm，滴血同時用秒表計時，每隔10 s用清潔針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，觀察有無血絲挑起，記錄凝血時間。從采血開始到挑起血絲止，所歷時間為凝血時間。采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件中的單因素方差分析法對各組凝血時間進行比較。

2.4.2 結(jié)果

三七素供試品對小鼠凝血時間的影響，如下表所示：

三七素供試品高、中、低劑量組與生理鹽水組比較，能顯著縮短凝血時間(P<0.01)。三七素供試品高、中、低劑量組與酚磺乙胺注射液組比較，能顯著縮短凝血時間(P<0.01)。

表3 七素供試品對小鼠凝血時間的影響

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05,**P<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，ΔP<0.05,Δ ΔP<0.01。

Note:Compared with saline group,*P<0.05,**P< 0.01;Compared with Etamsylate group,ΔP<0.05,Δ ΔP<0.01.

3 結(jié)論

工業(yè)三七藥渣要經(jīng)過用70%的乙醇，高溫數(shù)次提取，有些還要調(diào)節(jié)pH值，藥渣最后用蒸汽吹干，后曬干。而三七素極易溶于水且遇熱遇酸堿不穩(wěn)定，工業(yè)三七藥渣是否含有三七素是本課題能否進行的關(guān)鍵。

在HPLC檢測過程中，參照已有文獻[13-16]，考察了不同的流動相，甲醇：水(70∶30)、乙腈：0.05%磷酸溶液(5∶95)、乙腈：水(80∶20)等，根據(jù)色譜圖分離效果，確定流動相為溶劑A∶溶劑B(95∶5，v∶v)，溶劑A為0.001%的醋酸溶液，溶劑B為乙腈∶甲醇∶水(45∶10∶45,v∶v∶v)的混合溶液。所建立的高效液相色譜法測定三七素含量，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。因三七素水溶性好，反相高效液相出峰時間短，三七素粗提物、樹脂純化和結(jié)晶各階段高效液相色譜圖見圖3：各階段高效液相色譜證實了工業(yè)三七藥渣中含有三七素，并證實三七素在分離純化的各個步驟中存在。

目前文獻報道的三七素的分離純化方法[11]用到凝膠色譜柱Sephadex LH-20和CM SephadexC-25，但Sephadex LH-20和CM SephadexC-25價格昂貴，成本較高，不適合大工業(yè)生產(chǎn)所用。而本實驗參照文獻[12]采用價格低廉的001×7陽離子交換樹脂柱分離純化三七素，此方法簡單易行，成本低廉，適合大工業(yè)生產(chǎn)，但文獻[12]中以三七為原料，先用乙醇沉淀、正丁醇萃取除去皂苷成分再進行分離純化，而本實驗以提取過三七總皂苷后的工業(yè)藥渣為原料，在工業(yè)藥渣中加入純化水提取，提取液濃縮后加乙醇沉淀多糖等物質(zhì)，皂苷已提取，不需要正丁醇萃取除去皂苷，將上清液過001 × 7陽離子交換樹脂柱分離純化，成本低廉，適合于大工業(yè)生產(chǎn)。

本實驗最初將所得三七素供試品水溶液于50 ℃下烘干并進行了薄層鑒別，薄層鑒別未發(fā)現(xiàn)與對照品有相同斑點，推測三七素受熱不穩(wěn)定。后將三七素供試品水溶液采用真空冷凍干燥技術(shù)進行干燥，凍干產(chǎn)品薄層鑒別結(jié)果證實與對照品有相同斑點。考慮三七素是一個受熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，所以干燥過程要采用真空冷凍干燥技術(shù)。

據(jù)報道[10]三七中三七素的含量為0.5%～0.9%，故直接從三七中提取三七素成本較高。三七道地產(chǎn)地云南文山常年種植面積達(dá)到了12萬畝左右，產(chǎn)量9 000 噸。本實驗采用水提醇沉法從提取過三七總皂苷的工業(yè)三七藥渣中提取三七素，經(jīng)001 × 7陽離子樹脂柱純化、丙酮結(jié)晶、冷凍干燥得三七素供試品，高效液相色譜法測定三七素含量為59.03%，反推到三七藥渣中，三七素含量為0.72%，每年用于提取三七皂苷的三七約為1400 噸，皂苷提取后，每年從工業(yè)三七藥渣中棄去的三七素近3噸。藥理實驗證實：三七素供試品能明顯縮短凝血時間，具有良好的應(yīng)用前景，可用于止血藥物、醫(yī)療器械及日化產(chǎn)品的研發(fā)。本課題的研究有利于三七資源的綜合利用。