古蘭·托合提木拉提 葉爾努爾·吐蘇甫汗 馬玉蘭

1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院(烏魯木齊，830001)；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種多因素疾病，臨床上表現(xiàn)出雄激素過多癥，高胰島素血癥，肥胖癥，胰島素抵抗，無排卵和卵巢囊性卵泡等特征[1]。如未及時治療可能導(dǎo)致其他嚴重疾病[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)機體氧化應(yīng)激(OS)和低度炎癥可能是發(fā)生PCOS潛在原因[3]。與正常對照組比較，PCOS患者血清中OS標(biāo)志物，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)水平顯著變化，提示PCOS患者體內(nèi)存在OS[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗和代償性高胰島素血癥可誘導(dǎo)PCOS低度炎癥產(chǎn)生，PCOS患者血清中低度炎癥標(biāo)志物高敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)水平升高[5]。但OS和低度炎癥誘導(dǎo)PCOS發(fā)病機制尚未闡明。有研究建立了青春期前高脂飲食誘導(dǎo)PCOS大鼠模型[6]。為探討OS和低度炎癥在PCOS發(fā)病機制的作用，本研究探討青春期前高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激分子及血清低度炎癥標(biāo)志物的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10周齡、體重200～250g、SPF級SD雌性大鼠18只和3～4周齡、體重45～55g、SPF級SD雌性大鼠36只，均購置于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SYXK(新)2013-0002)。飼養(yǎng)溫度22±2℃，相對濕度55%±5%，12h晝夜交替，清潔飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF要求。本實驗獲新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會通過。

1.2 試劑與儀器

普通顆粒飼料(100%基礎(chǔ)飼料，含65%碳水化合物、21.5%蛋白質(zhì)、4%脂肪、9.5%其他)和高脂肪飼料(50%基礎(chǔ)飼料，17%豬油、19%豆油、6%蔗糖、6%酪蛋白、2%其他，含36%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、40%脂肪、4%其他)購自于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，血糖儀、全自動生化分析儀均購自于德國羅氏診斷有限公司。酶標(biāo)儀購置于MD公司。SOD、MDA、LPO試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1動物分組及模型制作雌性大鼠隨機分為對照組(n=18)采用普通顆粒飼料連續(xù)喂養(yǎng)105d；誘導(dǎo)組(n=18)，采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)105d[7]。

1.3.2體重及動情周期監(jiān)測每日稱重大鼠，分別于第42～49d、 70～77d、98～105d對每只雌性大鼠陰道涂片檢查， 0.9%NaCl生理鹽水清洗陰道收集陰道壁細胞并涂片。顯微鏡下檢查玻片上有核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞相對豐度，觀察大鼠動情周期變化。

1.3.3卵巢重量及組織學(xué)檢查分別于第49d、77d、105d采兩組大鼠空腹尾靜脈血，105d取血后處死大鼠并分離卵巢勻漿備用。另取喂養(yǎng)105d大鼠卵巢，稱重后取一側(cè)卵巢石蠟包埋,切片,染色后觀察。

1.3.4糖耐量試驗、胰島素抵抗指數(shù)及胰島素敏感檢測指數(shù)[7]糖耐量試驗：禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血測定空腹血糖(FG)，隨后以葡萄糖2g/kg灌胃大鼠，分別在0、30、60和120min后尾靜脈取血測定血糖值，計算曲線下面積(AUC)。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：放射免疫法檢測空腹胰島素(FI)，HOMA-IR =FI×FG/22.5。定量胰島素敏感性檢測指數(shù)(QUICKI)：QUICKI =1/[log(FG)+log(FI)]。

1.3.5檢測血清血脂、性激素、高敏C-反應(yīng)蛋白禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血。全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和hrCRP。放射免疫法測定促黃體生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)，雌二醇(E2)，孕酮(P)，睪酮(T)。

1.3.6檢測氧化應(yīng)激物黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力，硫代巴比妥酸法測定MDA和LPO含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)PCOS大鼠特征

陰道涂片評估發(fā)情周期發(fā)現(xiàn)，對照組發(fā)情周期規(guī)律，均4～5d；誘導(dǎo)組發(fā)情周期為第42～49、70～77、98～105d持續(xù)時間逐漸延長，發(fā)情周期不規(guī)律。與對照組比較，誘導(dǎo)組大鼠喂養(yǎng)105d后糖耐量AUC、空腹胰島素、HOMA-IR、QUICKI、TC、E2、P、T水平均發(fā)生顯著變化(P<0.05)(表1、2)；卵巢重量顯著增加，并觀察到多個囊狀擴張卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡，囊狀卵泡數(shù)、卵泡直徑、卵泡膜厚度增加，黃體數(shù)量下降(P<0.05)(表3)。

表1 兩組不同檢測時間各檢測指標(biāo)比較

*與對照組同一時間點比較P<0.05

表2 兩組不同檢測時間血清血脂及性激素水平比較

*與對照組同一時間點比較P<0.05

表3 兩組喂養(yǎng)105d卵巢組織變化

*與對照組比較P<0.05

2.2 誘導(dǎo)PCOS大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激水平變化

采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析比較兩組大鼠49d、77d、105d卵巢組織SOD、MDA和LPO水平：①不同時間點SOD(F=5.031，P=0.013)、MDA(F=4.639，P=0.018)和LPO(F=21.540，P=0.001)有差別；②SOD對照組(A)高于誘導(dǎo)組(B) (F=129.621，P=0.001)，誘導(dǎo)組(B)MDA和LPO高于對照組(A)(F=43.331、33.522，均P=0.001)；③兩組SOD、MDA變化趨勢有差別(F=14.061、5.191、14.980，P=0.001、0.012、0.001)。見圖1，2，3。

2.3 誘導(dǎo)PCOS大鼠血清hsCRP水平變化

采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析比較兩組大鼠49d、77d、105d血清hsCRP：①不同時間點hsCRP(F=1.224，P=0.056)無差別；②誘導(dǎo)組(B)hsCRP高于對照組(A)(F=2.342，P=0.041)；③兩組hsCRP變化趨勢無差別(F=0.741，P=0.215)，見圖4。

圖1 兩組大鼠卵巢組織SOD水平變化

圖2 兩組大鼠卵巢組織MDA水平變化

圖3 兩組大鼠卵巢組織LPO水平變化

圖4 兩組大鼠卵巢組織hsCRP水平變化

2.4 誘導(dǎo)組大鼠氧化應(yīng)激和低度炎癥的相關(guān)性

誘導(dǎo)組大鼠氧化應(yīng)激分子SOD與MDA、LPO、hrCRP、HOMA-IR、空腹胰島素呈負相關(guān)，MDA與LPO、hrCRP、HOMA-IR呈正相關(guān)，LPO與hrCRP和T呈正相關(guān)，hrCRP與T呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表4。

表4 誘導(dǎo)組大鼠氧化應(yīng)激和低度炎癥相關(guān)性分析

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3 討論

研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者不同程度出現(xiàn)血清OS標(biāo)志物水平異常[8]。機體氧化還原平衡被打破時會產(chǎn)生OS損傷，過度損傷可導(dǎo)致細胞功能異常，甚至細胞凋亡。MDA是氧化應(yīng)激狀態(tài)下細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，間接反映氧化應(yīng)激水平。LPO是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，通過使受體、酶和離子通道失活影響膜流動性或損傷膜蛋白，甚至破壞膜的完整性最終導(dǎo)致細胞死亡。相對于氧化作用，SOD是重要的機體抗氧化標(biāo)志物。研究表明PCOS患者卵泡液中MDA含量增高，SOD活力降低，提示卵泡液OS水平增高[4]。但卵巢是PCOS病理損害的直接器官，PCOS患者卵巢OS水平尚不清楚。利用PCOS動物模型研究PCOS患者卵巢OS變化，闡明OS對PCOS發(fā)生的影響。

本研究采用青春期高脂飲食誘導(dǎo)大鼠PCOS，其特征與臨床PCOS患者癥狀相似。大鼠體內(nèi)血清T顯著增加，同時卵巢中MDA、LPO濃度在早期開始增加，而SOD活性降低，血清hsCRP也顯著增加。這些結(jié)果表明雄激素、OS標(biāo)記物和炎癥標(biāo)記物的增加在本次研究PCOS動物模型中發(fā)病相對較早。大鼠體內(nèi)血清T、hsCRP增加，說明誘導(dǎo)的PCOS大鼠發(fā)生低度炎癥。另有研究表明來曲唑誘導(dǎo)PCOS大鼠中也發(fā)生低度炎癥[9]。說明低度炎癥在動物PCOS發(fā)病過程中可能發(fā)揮了重要作用，但其機制尚不清楚。

有研究表明，雄激素過多能夠激活血液中單核細胞，這可能是PCOS產(chǎn)生炎癥的潛在機制[10]。肥胖與胰島素抵抗的發(fā)展與體內(nèi)hsCRP水平的升高相關(guān)[11-12]。而用二甲雙胍治療PCOS動物血清hsCRP顯著降低[9]。在本研究PCOS動物模型中，血清hsCRP水平在高脂飲食喂養(yǎng)第105d顯著增加，且與OS標(biāo)志物SOD、MDA、LPO和T水平存在相關(guān)性，表明該模型中低度炎癥的增加可能是由氧化應(yīng)激的早期發(fā)展引起。

OS對卵泡發(fā)生、卵母細胞成熟、類固醇生成和黃體溶解產(chǎn)生不利影響[13]。 研究表明在來曲唑誘導(dǎo)的PCOS模型中，血清hsCRP和卵巢OS標(biāo)記物(MDA、LPO和SOD)的水平均高于對照[9，14]。Pandey等研究顯示，來曲唑處理大鼠hsCRP和OS標(biāo)記物(LPO、過氧化氫酶和SOD)的水平顯著高于對照。雖然曲唑處理第21天 hsCRP和LPO水平下降，但仍高于對照組。該研究中來曲唑處理大鼠卵巢組織SOD先減少后增加[9，14]，與本研究結(jié)果不完全一致。這可能與對照、檢測方法有關(guān)。盡管如此，Pandey等[9]研究也表明hsCRP與OS存在強相關(guān)性。表明在PCOS樣病癥發(fā)展過程中OS和炎癥標(biāo)志物存在密切關(guān)聯(lián)。囊性卵泡的增加與卵巢中胰島素敏感性的降低有關(guān)。高雄激素血癥，OS水平升高和低度炎癥可能是導(dǎo)致該PCOS動物模型中出現(xiàn)囊性卵泡、胰島素抵抗和肥胖的主要因素[15-16]。

總之，本研究檢測了青春期高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠中OS標(biāo)志物和低度炎癥隨時間的變化，這些變化與該模型中大鼠PCOS樣特征的發(fā)展相關(guān)。該模型中低度炎癥和OS還與雄激素過多密切相關(guān)。這個結(jié)果表明OS和低度炎癥可能在動物發(fā)生PCOS過程中發(fā)揮作用，也可能是PCOS誘導(dǎo)的主要原因，OS和低度炎癥及其相關(guān)信號通路有望作為治療PCOS的藥物開發(fā)的新靶標(biāo)。