付俊文，何雪錸，侯能易，熊海波，龐明輝，

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610072)

當前結(jié)直腸癌是最常見的癌癥之一。我國在2015年新增的結(jié)直腸癌患者高達37.6萬，而死于該病的患者達19.1萬[1]。美國癌癥協(xié)會報道近十年來美國結(jié)直腸癌的總體發(fā)病率和死亡率略呈下降趨勢，但在低于50歲人群中的發(fā)病率增加了22%[2]。目前大量的研究發(fā)現(xiàn)許多基因和分子水平異常表達對結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要價值。

瞬時受體電位香草酸亞型 1(TRPV1)屬于瞬時感受器電位(TRP)離子通道家族，由于其能被辣椒素激活，也稱為辣椒素受體，是一種非選擇性陽離子配體門控通道[3，4]。由于它在傳入感覺神經(jīng)元中占主導(dǎo)地位，TRPV1被認為是對熱、機械和化學(xué)刺激反應(yīng)的關(guān)鍵傳感器[5]。與此同時，TRPV1也與機體的新陳代謝、長壽、炎癥和癌癥有很大的關(guān)系[6～9]。TRPV1與腫瘤關(guān)系密切，包括乳腺癌[10，11]，肝癌[12]，舌鱗狀細胞癌[13]，前列腺癌[14，15]，胰腺癌[16]，Vinuesa等[17]對結(jié)腸炎相關(guān)癌癥模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中TRPV1在腸道中有免疫調(diào)節(jié)作用，影響腸黏膜中炎性細胞的活性，從而改變腫瘤微環(huán)境，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。Petrus等[18]在多發(fā)性腸道腫瘤的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞中的內(nèi)源性TRPV1表達可能直接影響生長因子受體信號傳導(dǎo)，并抑制腫瘤形成。

然而TRPV1在人結(jié)腸癌和癌旁、正常組織的差異表達及其與人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性未見報道。因此，我們在前期通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRPV1在結(jié)腸癌組織和正常組織中存在差異表達的基礎(chǔ)上，收集臨床標本，通過免疫組織化學(xué)的方法驗證腫瘤組織、癌旁組織以及正常組織的TRPV1蛋白表達，并進一步在結(jié)腸癌細胞系中探索TRPV1導(dǎo)致的癌細胞的生物學(xué)行為變化。

1 資料與方法

1.1一般資料收集四川省人民醫(yī)院胃腸外科2018年5～8月行結(jié)腸癌根治性手術(shù)的腫瘤標本10例、距腫瘤邊緣0.5 cm的癌旁組織10例，距腫瘤邊緣5 cm以上的正常結(jié)腸組織6例，所有的腫瘤組織最后經(jīng)病理檢查證實為原發(fā)性結(jié)腸癌。人結(jié)腸癌細胞系HCT116來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院(中國上海)。

1.2方法

1.2.1在石蠟包埋的組織切片上進行免疫組織化學(xué)分析 在室溫下使用3%過氧化氫進行抗原修復(fù)15分鐘。隨后，將切片與適當?shù)囊豢筎RPV1(Cell Signaling Technology，MA，USA)在4 ℃溫育過夜。在37 ℃培養(yǎng)箱中再加熱30分鐘后，將切片與適量的生物素化山羊抗兔IgG在37 ℃下孵育30分鐘。使用SABC-POD試劑盒(北京華爾光伏科技有限公司，中國北京)進行TRPV1免疫組織化學(xué)染色，然后用蘇木精復(fù)染。采用PBS代替一抗作為陰性對照組。通過使用Nikon計算機圖像系統(tǒng)(Nikon，Tokyo，Japan)隨機選擇每個部分中的總共五個視野(放大倍數(shù)，×400)，然后使用Image-Pro Plus軟件評估免疫反應(yīng)性區(qū)域。

1.2.2細胞活力測定 人結(jié)直腸癌細胞系HCT116獲自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院(中國上海)。將HCT116細胞在補充有10%胎牛血清(FBS；Gibco，CA，USA)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃，5%CO2中溫育。通過細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8；Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)測定法測定細胞活力。將每孔約7×103個細胞接種在96孔板中。孵育后，原始培養(yǎng)基為取出并將100 μl新鮮培養(yǎng)基與CCK-8以10∶1的比例混合，在37 ℃下向各孔中加入30分鐘。通過酶標儀(Bio-Rad，CA，USA)在450 nm下測量吸光度值。

1.2.3Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen；BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)檢測細胞凋亡。在收集凋亡物之前，將HCT116細胞與辣椒素一起溫育。收集細胞并重懸于含有5 μl膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素和5 μl氧化丙啶(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，CA，USA)的100 μl結(jié)合緩沖液(1×105個細胞)中，并在室溫(20～25 ℃)下孵育。在黑暗中持續(xù)15分鐘。使用FACSCaliburTM流式細胞儀(BD Biosciences)在1小時內(nèi)檢測細胞凋亡。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。通過方差分析(ANOVA)與Dunnett-t檢驗比較兩組之間的差異。所有方差分析數(shù)據(jù)均通過方差齊性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TRPV1在TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)腸癌樣本和正常組織樣本中的表達在TCGA數(shù)據(jù)庫中共收錄結(jié)腸癌組織275例，正常組織349例。發(fā)現(xiàn)TRPV1在結(jié)腸癌組織中的表達明顯低于在正常組織中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如圖1。

圖1 TRPV1在結(jié)腸癌組織和正常組織中的表達 TRPV1在結(jié)腸癌組織(左側(cè)深灰色)中的表達明顯低于在結(jié)腸正常組織中的表達(右側(cè)淺灰色)

2.2TRPV1在結(jié)腸癌組織中的表達如圖2所示，與正常組織相比，TRPV1的蛋白表達水平在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中較低。與癌旁組織相比，腫瘤組織中TRPV1的蛋白表達水平顯著降低。表明在結(jié)腸癌中TRPV1表達顯著降低，提示TRPV1在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起抑制作用，是腫瘤的抑制因子。

圖2 TRPV1的蛋白表達水平 a：400鏡下組織免疫組織蛋白表達；b：TRPV1蛋白相對表達量 TRPV1的表達變化(腫瘤組織n=10，癌旁組織n=10，正常組織n=6)，與正常組相比，* P <0.05和** P <0.01，## P <0.01

2.3體外細胞實驗結(jié)果表明，與結(jié)腸癌細胞系HCT116未做任何處理相比，辣椒素處理激動TRPV1后顯著抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力，并且能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。用CCK-8檢測辣椒素處理后的結(jié)腸癌細胞活力，與未經(jīng)指定處理的結(jié)腸癌細胞作對照(結(jié)果如圖3)，TRPV1激活后，結(jié)腸癌HCT116細胞增殖能力顯著降低(P<0.01)。繼續(xù)用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒檢驗處理后結(jié)腸癌細胞的凋亡情況，與未經(jīng)指定處理的結(jié)腸癌細胞作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如圖4)，經(jīng)辣椒素處理后，結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡增多，表明TRPV1能夠促進結(jié)腸癌細胞凋亡。

圖3 CCK-8測定法測定細胞活力

圖4 細胞凋亡情況 a：流式細胞學(xué)術(shù)檢測細胞凋亡；b：條形圖凋亡率

3 討論

TRPV1分布廣泛，在多種細胞類型中普遍表達[19]。在腸道中，TRPV1調(diào)節(jié)如運動，分泌，循環(huán)和內(nèi)臟傷害感受等生理功能[20～22]。我們的研究揭示并驗證了TRPV1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織和正常組織，在癌旁組織中的表達顯著低于正常組織，說明TRPV1可能作為腫瘤的抑制因子發(fā)揮作用。進一步，我們在結(jié)腸癌細胞系中驗證了TRPV1的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)它有抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的特點。

TRPV1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，TRPV1(以及TRPV4)離子通道在肝母細胞瘤HepG2細胞中介導(dǎo)Ca2+轉(zhuǎn)運[12]，被認為與腫瘤細胞遷移相關(guān)[23]。有學(xué)者在對MCF-7乳腺癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)TRPV1均可誘導(dǎo)細胞生長的抑制，但其機制還有待闡明[11]。在前列腺癌研究中，α1D腎上腺素能受體和TRPV1(升高)之間的串擾能夠促進細胞增殖，表明了靶向α1D-AR和TRPV1通道治療前列腺癌的可能性[15]。也有文獻報道[17]，TRPV1 在腸道中具有免疫調(diào)節(jié)功能，其C感覺神經(jīng)元釋放神經(jīng)肽，如血管活性腸肽(VIP)和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)(免疫功能調(diào)節(jié)劑[24])，這些神經(jīng)肽通過影響腸粘膜中炎性細胞的活性，導(dǎo)致促炎細胞因子的釋放減少，進而使轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和核因子kappaB(NF-kB)驅(qū)動的上皮腫瘤發(fā)生的風(fēng)險降低，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展。還有報道[18]顯示TRPV1離子通道在Ca2+/鈣蛋白酶介導(dǎo)的磷酸酶活性調(diào)節(jié)腸上皮中的表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)中起重要作用，有助于預(yù)防腸道腫瘤發(fā)生。我們在結(jié)腸細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，TRPV1的活化導(dǎo)致HCT116細胞系增殖能力下降、凋亡顯著增多。我們證實了TRPV1在結(jié)腸癌中的差異表達，對其在結(jié)腸癌細胞中的生長抑制作用做了初步探討，闡述了TRPV1作為抑癌基因影響腫瘤生長，為臨床將其作為結(jié)腸癌診斷標志物提供了證據(jù)。遺憾的是，我們沒有對TRPV1介導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡的機制進行深入探討，這是課題組下一步工作的重點，我們將系統(tǒng)挖掘TRPV1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。