何 煦，葉尚勉，董丹丹，李 科

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.中心實(shí)驗(yàn)室，b.病理科，四川 成都 610072)

結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率不到10%，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌患者死亡的主要因素[1]。隨著診治水平的提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步下降，但如何提高結(jié)直腸癌的早期診斷率仍是全球性的科研難點(diǎn)和熱點(diǎn)。人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)是一種非經(jīng)典的HLA-I類抗原，正常情況下HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細(xì)胞表達(dá)，在分化成熟的正常成人組織中無表達(dá)。在病理情況下，HLA-G可以在腫瘤、器官移植和自身免疫性疾病等情況下產(chǎn)生[2]。本研究對(duì)HLA-G在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)進(jìn)行了分析，并且探討了HLA-G的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間及生存率之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HLA-G在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2018年1月在四川省人民醫(yī)院確診的201例結(jié)直腸癌患者，均為首次發(fā)現(xiàn)癌癥，且無遺傳性結(jié)腸癌綜合征家族史，并且未接受術(shù)前化療和放療。男106例，女95例，平均年齡64歲。原發(fā)性結(jié)腸癌80例，原發(fā)性直腸癌121例。臨床病理分期分級(jí)按照AJCC 和UICC制定的TNM標(biāo)準(zhǔn)。I期占21% (42/201)，II期38% (77/201)，III期39% (78/201)，IV期2% (4/201)。術(shù)后所有Ⅰ～Ⅲ期患者接受口服5-氟尿嘧啶治療，Ⅳ期患者接受包括5-氟尿嘧啶治療的系統(tǒng)治療。85例患者在檢測(cè)HLA-G后隨訪，中位隨訪時(shí)間27個(gè)月(3～36個(gè)月)，其中20例患者在隨訪過程中死亡。所有的組織切片取自外科術(shù)后病理組織，均為原發(fā)性直結(jié)腸腺癌，轉(zhuǎn)移性癌組織未納入，所有病例均為病理診斷結(jié)果。

1.2抗HLA-G單克隆抗體(HGY)的制備從人胎盤組織經(jīng)兩個(gè)連續(xù)抗體親和層析柱(抗HLA-G抗體親和層析柱和抗HLA-Gβ2微球蛋白抗體親和層析柱)分離純化獲得天然HLA-G蛋白。然后用天然HLA-G蛋白按標(biāo)準(zhǔn)方法免疫BALA/C小鼠。再用免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2鼠骨髓瘤細(xì)胞株融合成雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)用有限稀釋法，抗體捕獲酶聯(lián)免疫測(cè)定法和Western blot等方法篩選出一株分泌抗HLA-G單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為HGY。該細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆經(jīng)小鼠抗體分型試劑盒確定為IgG3。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步證明該抗體結(jié)合位點(diǎn)在HLA-G的α1區(qū)域。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中HLA-G的表達(dá)，通用型SP試劑盒購自北京中杉金橋公司，抗HLA-G蛋白單克隆抗體的工作濃度為1∶400。組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗HGY 4 ℃過夜。PBS緩沖液洗3次，加S-P試劑盒，鏡下顯色后，用蘇木精對(duì)比染色。每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。以癌細(xì)胞膜，細(xì)胞漿，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物判為陽性表達(dá)，由兩位病理學(xué)專家在光鏡下判讀結(jié)果，根據(jù)顯色百分比和顯色信號(hào)的強(qiáng)度，將顯色結(jié)果分為四級(jí)：(-)組織標(biāo)本無染色；(+)陽性信號(hào)少于25%的癌癥組織，和/或顯色信號(hào)弱；(++)陽性信號(hào)在25%～50%，和/或信號(hào)強(qiáng)度中等；(+++)陽性信號(hào)多于50%，和/或顯色為強(qiáng)陽性。

1.4宿主免疫反應(yīng)評(píng)估采用結(jié)直腸癌患者腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤數(shù)量評(píng)估宿主的免疫反應(yīng)。在5個(gè)高倍視野下，計(jì)數(shù)浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，將宿主免疫反應(yīng)評(píng)分為強(qiáng)(+++)、中(++)、弱(+)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，生存率的分析采用Kaplan-Meier法。建立Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，確定影響生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1原發(fā)性結(jié)直腸癌中HLA-G表達(dá)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中，65%(130/201)出現(xiàn)HLA-G表達(dá)，其中18%(24/130)為強(qiáng)表達(dá)(+++)，31%(41/130)為中度表達(dá)(++)，50%(65/130)為弱表達(dá)(+)。HLA-G的表達(dá)部位在細(xì)胞膜(8%)或胞漿中(2%)，兩個(gè)部位同時(shí)表達(dá)最多見(90%)，71例結(jié)直腸癌標(biāo)本(35%)未見HLA-G表達(dá)。正常結(jié)直腸組織和良性腺瘤組織中未見HLA-G表達(dá)。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中HLA-G的表達(dá)(×200) a：結(jié)直腸癌HLA-G表達(dá)強(qiáng)陽性；b：正常結(jié)直腸組織中無HLA-G表達(dá)

2.2不同臨床病理學(xué)參數(shù)間HLA-G的表達(dá)HLA-G的表達(dá)在腫瘤部位、腸壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病分期方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，在年齡、性別、組織分化程度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理學(xué)參數(shù)間HLA-G的表達(dá)

2.3HLA-G在結(jié)直腸癌的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系從圖2可以看出，HLA-G表達(dá)強(qiáng)陽性的區(qū)域淋巴細(xì)胞少，而HLA-G表達(dá)陰性的區(qū)域有大量淋巴細(xì)胞浸潤。HLA-G表達(dá)陽性與HLA-G表達(dá)陰性的腫瘤組織相比，淋巴細(xì)胞的浸潤被明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.677，P< 0.001)，見表3。

圖2 HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系(×200) a：HLA-G表達(dá)強(qiáng)陽性的區(qū)域淋巴細(xì)胞少；b：HLA-G表達(dá)弱陽性的區(qū)域大量淋巴細(xì)胞浸潤；c：HLA-G陰性區(qū)域大量淋巴細(xì)胞浸潤

宿主免疫反應(yīng)病例數(shù)HLA-G 表達(dá)(-)(+)(++)(+++)P弱9717302822中等 54261882強(qiáng)502817500.001

2.4HLA-G在結(jié)直腸癌的表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系85例患者在36個(gè)月隨訪期間，20例患者因腫瘤發(fā)生死亡，其中48例HLA-G陰性患者中2例死亡，37例HLA-G陽性患者中18例死亡，HLA-G陰性患者的生存率(96%)明顯高于HLA-G陽性患者(51%)(χ2=22.98，P= 0.001)。分析其它臨床病理學(xué)因素，如年齡、性別、浸潤深度、組織分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、疾病分期與患者生存率之間的關(guān)系，其中淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移和疾病分期與生存率有關(guān)(表4)。Cox多因素分析確定HLA-G的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移一樣，也是結(jié)直腸癌一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(P= 0.021)，見表5。

表4 生存率與各種臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

表5 結(jié)直腸癌患者生存率的影響因素分析

3 討論

HLA-G是一種非經(jīng)典的HLA-I類抗原，該白細(xì)胞抗原的基因同經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原的基因都位于第6對(duì)染色體的短臂上，基因和表達(dá)的產(chǎn)物與經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原有86%雷同[3]。在正常生理情況下，HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細(xì)胞和其他少量的組織，如胸腺，角膜和骨髓造血祖細(xì)胞等表達(dá)(HLA-A，-B 和-C在幾乎所有的有核體細(xì)胞均有表達(dá))，在母體對(duì)胎兒的免疫耐受起重要作用，在妊娠時(shí)可以保護(hù)胎兒免受母親免疫系統(tǒng)的排斥[4]。HLA-G具有抑制自然殺傷細(xì)胞 (NK)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，是機(jī)體免疫耐受機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子[5，6]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G在大多數(shù)常見惡性腫瘤組織又重新出現(xiàn)表達(dá)，HLA-G在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)具有較高的腫瘤特異性[7～9]。本實(shí)驗(yàn)201例結(jié)直腸癌的研究數(shù)據(jù)表明，有較高比例的患者(65%)出現(xiàn)HLA-G蛋白的表達(dá)，而在正常結(jié)直腸組織則無表達(dá)。在分析了結(jié)直腸癌患者HLA-G的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，HLA-G的表達(dá)與組織分化程度、腸壁浸潤深度、疾病分期有關(guān)，這些結(jié)果提示HLA-G的免疫組織化學(xué)檢測(cè)可作為判斷結(jié)直腸癌的一個(gè)輔助診斷指標(biāo)。

腫瘤在發(fā)生和發(fā)展變化過程中，要表達(dá)一些不同于正常組織的腫瘤抗原，免疫系統(tǒng)對(duì)這些發(fā)生癌變的細(xì)胞有排斥消除的功能，稱之宿主的免疫監(jiān)視。但在已經(jīng)患上癌癥患者的體內(nèi)，癌細(xì)胞明顯地逃過了宿主的免疫監(jiān)視，這種現(xiàn)象稱之為腫瘤的免疫逃逸[10，11]。由于HLA-G是一種免疫抑制分子，能夠抑制免疫應(yīng)答，可引起腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移，因此如果腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達(dá)，便能更好地解釋腫瘤免疫逃逸機(jī)制。在研究HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系中我們發(fā)現(xiàn)，HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)成負(fù)相關(guān)關(guān)系，HLA-G表達(dá)陽性的區(qū)域宿主免疫反應(yīng)弱于HLA-G陰性區(qū)域，說明HLA-G可能參與了宿主的免疫反應(yīng)，是腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫反應(yīng)的策略之一。此外，HLA-G的表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)，HLA-G陰性患者的生存率明顯高于HLA-G陽性患者，也表明HLA-G可通過抑制宿主免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫應(yīng)答，使腫瘤易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而使患者生存率降低。

綜上，本研究比較了HLA-G在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中表達(dá)的差別，以及與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，并且同時(shí)分析了與生存率之間的關(guān)系，通過以上結(jié)果表明，HLA-G分子在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后中都有重要作用，它參與了腫瘤免疫逃逸機(jī)制。HLA-G在惡性腫瘤的表達(dá)可能具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠用于腫瘤的診斷和預(yù)后的指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)，是一個(gè)較為理想的腫瘤標(biāo)志物。