唐 艷 鄧蘇辛

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一類發(fā)生于糖尿病患者，以心力衰竭為主要臨床表現(xiàn)，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈性心臟病(簡稱冠心病)，以及其他心臟病變來解釋的心肌疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前未被完全了解。微RNA(miRNA)為一種小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA分子的3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)配對并與之結(jié)合，從而降解靶mRNA，抑制翻譯，參與多種心血管疾病的病理生理過程[1]。近來研究表明，miRNA與DCM有一定的相關(guān)性，未來可能成為DCM的治療新靶向。在眾多miRNA中， miRNA-21(miR-21)在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，參與許多心血管疾病如缺血性心肌病、心肌肥厚、心力衰竭等病理生理過程。miRNA未來可能成為DCM的治療新靶點(diǎn)[2]。miR-21介導(dǎo)的心血管效應(yīng)的靶基因有4個，分別是程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)、磷酸脂酶-張力蛋白同源物(PTEN)、sprouty1(SPRY1)和sprouty2(SPRY2)。其中PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有蛋白脂酶和磷酸酶雙特異活性的靶基因,通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如：磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、黏著斑激酶(FAK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p53/雙微體2(MDM2)、NF-κB在增生性血管疾病、缺血性心肌病、心臟肥大、心力衰竭和心臟纖維化等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[3]。本研究小組在前期細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-21能通過負(fù)性調(diào)控PTEN抑制心肌細(xì)胞凋亡和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，PTEN/Akt/叉頭框蛋白(FOX)O3a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中[4-5]。本研究旨在檢測DCM患者血清miR-21和PTEN的表達(dá)水平，結(jié)合超聲心動圖相關(guān)指標(biāo)和N末端B型鈉肽前體(NT-proBNP)行相關(guān)性分析，探討血清miR-21和PTEN在DCM患者中的臨床意義，為DCM的診斷和治療開辟新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇 2017年5—12月在南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的DCM患者40例為DCM組，其中男30例、女10例；平均年齡 (62.5±2.1)歲；另選擇同期同一醫(yī)院行體格檢查的健康者20例為正常組，其中男10例、女10例；平均年齡(61.9±1.8)歲。DCM的診斷參照WHO/國際心臟病學(xué)會聯(lián)合會(ISFC)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。兩組受檢者均為自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性糖尿病、惡性腫瘤、外傷、感染、貧血和自身免疫性疾病、長期服用激素類藥物的患者。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 采集兩組受檢者清晨空腹肘靜脈血3 mL，檢測血清NT-proBNP水平；同時另留取肘靜脈血5 mL，置于真空無抗凝管中,樣本置于離心機(jī)中，1 h內(nèi)4 ℃,3 000 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm)，將上層液轉(zhuǎn)移至1.5 mL eppendorf管中12 000 r/min離心5 min(離心半徑5 cm)， 再將上層血清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL eppendorf管中，標(biāo)記并將其分裝，保存于-80 ℃冰箱，樣本處理于2 h內(nèi)完成。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR)檢測血清miR-21和PTEN mRNA的表達(dá)水平，ELISA法檢測各組血清PTEN蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。由本院超聲科醫(yī)師對兩組受檢者進(jìn)行超聲心動圖檢查，測量左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左心室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)、舒張早期/舒張末期心室充盈速率(E/A)。

1.2.2 主要儀器和試劑 全自動生化儀為瑞士羅氏公司產(chǎn)品，定量熒光PCR儀為美國ABI生物公司產(chǎn)品。QIAzol裂解液、miRNeasy 血清(血漿)提取試劑盒購自德國Qiagen公司，PrimeScrip?miRNA cDNA一步合成試劑盒、SYBR?Green熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，1 kp DNA ladder標(biāo)志物購自美國Fermentas公司，miR-21、PTEN mRNA、 β-actin和U6引物購自上海捷瑞生物有限公司，ELISA試劑盒購自上海BG公司。

1.2.3 血清miR-21和PTEN mRNA相對表達(dá)量 ①總RNA提?。喝?00 mL血清與5倍體積的QIAzol裂解液混勻，靜置15 min后提取總RNA，按miRNeasy 血清(血漿)提取試劑盒操作說明進(jìn)行，用氯仿去蛋白質(zhì)處理，乙醇沉淀RNA成分，加入12 mL DEPC水溶解RNA。②cDNA合成：按照PrimeScrip?miRNA cDNA一步合成試劑盒說明書將所提取的RNA合成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min聚合腺苷酸(PolyA)加尾和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，85 ℃ 5 s酶失活，合成20 μL反轉(zhuǎn)錄液，將其稀釋5倍用于PCR分析。③PCR：參照日本TaKaRa公司SYBR?Green熒光定量PCR試劑盒說明方法制備 20 μL反應(yīng)體系，于 ABI 7500熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，miR-21正向引物為5’-CCT GCC TGA GCA CCT CGT GC-3’,反向引物為5’-GAC TGT GAC GAC TAC CCC AA-3’，產(chǎn)物75 bp。預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45個循環(huán)。內(nèi)參基因U6正向引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物: 5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，產(chǎn)物109 bp。預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45個循環(huán)。PTEN mRNA正向引物為 5’-TCA TGG TGC TGG TGG CTC TG-3’，反向引物為5’ -TGT GCT GGG GTT GGC TAT TT-3’，產(chǎn)物146 bp。預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因β-actin正向引物為5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’，反向引物為5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’，產(chǎn)物103 bp。預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。所有引物均由上海捷瑞生物公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用2-△△Ct比較法計算miR-21相對表達(dá)量。

1.2.4 血清 PTEN 蛋白質(zhì)相對表達(dá)量 測定所有入組患者的血清標(biāo)本中PTEN 蛋白。按ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀型號為Bio-Red 680，在波長為 450 nm處測定吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清NT-proBNP水平和超聲心動圖檢查結(jié)果比較 DCM組血清NT-proBNP水平和LVEDd均高于正常組(t=5.80、37.42，P值均<0.05)；LVEF、E/A均顯著低于正常組(t=46.71、14.41，P值均<0.05)。見表1。

組別NNT-proBNP(ng/L)LVEDd(mm)LVEF(%)E/A正常20130.97±44.3039.10±2.2959.35±1.401.39±0.07DCM404 688.76±3 501.04①62.88±2.33①45.27±0.92①0.82±0.17①

與正常組比較：①P<0.05

2.2 血清miR-21相對表達(dá)量 DCM組miR-21相對表達(dá)量是正常組的(4.08±0.16)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-88.12，P<0.05)。

2.3 miRNA表達(dá)量與各變量間的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，miR-21表達(dá)量與NT-proBNP和LVEDd呈正相關(guān)(r=0.977、0.616，P值均<0.05)，與LVEF和E/A呈負(fù)相關(guān)(-0.985、-0.884，P值均<0.05)。多重線性相關(guān)分析顯示，血清miR-21表達(dá)量與LVEDd呈正相關(guān)(P<0.01)，見表2。

表2 miR-21表達(dá)量與各變量間的多重線性相關(guān)分析

2.4 血清 PTEN mRNA相對表達(dá)量 DCM組PTEN mRNA相對表達(dá)量是正常組的(0.27±0.03)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=91.52，P<0.05)。

2.5 PTEN mRNA表達(dá)量與各變量間的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，PTEN mRNA表達(dá)量與LVEF和E/A呈正相關(guān)(r=0.983，P<0.01和r=0.879，P<0.05)，PTEN mRNA表達(dá)量與LVEDd、NT-proBNP水平和miR-21表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.977，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重線性相關(guān)分析顯示，血清PTEN mRNA表達(dá)量與LVEF呈正相關(guān)(P<0.01)，與miR-21和NT-proBNP水平呈負(fù)相關(guān)(P值均<0.05),見表3。

表3 PTEN mRNA表達(dá)量與各變量間的多重線性相關(guān)分析

2.6 血清PTEN蛋白質(zhì)相對表達(dá)量 DCM組PTEN蛋白質(zhì)相對表達(dá)量是正常組的 (0.24±0.03)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=50.65，P<0.05)。

2.7 PTEN蛋白質(zhì)相對表達(dá)量與各變量間的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)量與LVEF和E/A呈正相關(guān)(r=0.984，P<0.01；r=0.879，P<0.05)，PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)量與LVEDd、NT-proBNP和miR-21表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.978，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重線性相關(guān)分析顯示，血清PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)量與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)，與miR-21表達(dá)量和NT-proBNP水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)量與各變量間的多重線性相關(guān)分析

3 討 論

DCM是一種以心肌結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)為特征的特異性心肌病， 其發(fā)生不依賴于冠心病、 高血壓和其他心臟疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、心肌代謝紊亂、心肌微血管病變、心肌自主神經(jīng)病變、細(xì)胞因子異常等，目前未被完全了解。目前,DCM尚無特異性治療，一般采用控制血糖、抗心力衰竭等，療效欠佳，預(yù)后差。

miRNA是真核生物中一種長度約為22個核苷酸大小、參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA，可特異性識別靶mRNA的3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)并與之結(jié)合，從而降解靶mRNA，抑制翻譯，發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞活動，參與眾多疾病的病理生理過程[1]。近來研究表明，miRNA通過調(diào)控心肌細(xì)胞肥厚、凋亡、心肌纖維化、線粒體功能障礙、心室重構(gòu)、內(nèi)皮細(xì)胞修飾等方面在DCM的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，干預(yù)miRNA可能會影響DCM的病情進(jìn)展，未來可能成為DCM的治療新靶向[2]。miR-21是其中一種由單個基因編碼的、定位在染色體17q23.2，與編碼跨膜蛋白的基因VMP1(或TMEM49)重疊，并獨(dú)立地由miR-21前轉(zhuǎn)錄本(如pri-miRNA -21)中一個相對保守的啟動子轉(zhuǎn)錄而成[6]的miRNA，其在心肌組織和許多主要的心血管細(xì)胞類型包括血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞上高表達(dá)，在許多心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭、心臟肥大中呈差異性表達(dá)，參與各種心血管疾病的病理生理分子機(jī)制[2]。近年來miR-21在心血管生理和病理過程中的作用備受關(guān)注[7]。本研究結(jié)果顯示，DCM血清NT-proBNP水平和LVEDd均顯著高于正常組，LVEF和E/A均顯著低于正常組；血清miR-21水平明顯升高，且其表達(dá)水平與LVEDd、NT-proBNP呈正相關(guān)，與LVEF和E/A呈負(fù)相關(guān)，血清NT-proBNP水平升高，LVEF降低是心力衰竭的表現(xiàn)；LVEDd增大是心室重構(gòu)的大體表現(xiàn)，基因分子水平表現(xiàn)為多種細(xì)胞因子水平異常、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控異常等。提示血清miR-21很可能參與DCM的發(fā)生發(fā)展，未來可能成為DCM危險分層的新診斷標(biāo)志物和潛在的治療新靶點(diǎn)。

miR-21介導(dǎo)的心血管效應(yīng)的靶基因，分別為PDCD4、PTEN、SPRY1和SPRY2，這4個靶基因具有明顯細(xì)胞和條件特異性[8]。PTEN基因在胚胎發(fā)育，細(xì)胞生長、分化、凋亡和遷移的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Oudit等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-21通過調(diào)控PTEN/AKT通路延緩心室重構(gòu)和心力衰竭的進(jìn)展。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪能激活PTEN/Akt信號通路上調(diào)miR-21的表達(dá)從而抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷。Tao等[11]發(fā)現(xiàn)，生長抑制因子-5可能通過調(diào)控miR-21的表達(dá)來抑制心肌纖維化，PTEN/Akt通路可能參與其中。Haque等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過調(diào)控PTEN/Akt通路水平對糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)揮潛在性的靶向治療作用。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-21水平可能通過調(diào)控PTEN/Akt通路對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。Shi等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖，未來可能對缺血性心臟病的治療發(fā)揮潛在作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCM組血清PTEN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均明顯降低，且與LVEF和E/A呈正相關(guān)，與LVEDd、NT-proBNP、miR-21表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。因此推測，在DCM中，高表達(dá)的miR-21可能通過與PTEN基因結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在翻譯水平抑制靶基因的表達(dá)，在DCM的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。