姬向波 ， 李新鋒 ， 謝娜娜 ， 高小韓 ， 李婉濤 ， 向瑞平

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南省畜禽遺傳資源保護(hù)工程技術(shù)研究中心 ， 河南 鄭州 450046)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)屬于α反轉(zhuǎn)錄病毒群病毒屬成員，通常根據(jù)血清中和試驗(yàn)、病毒宿主范圍、囊膜糖蛋白的抗原結(jié)構(gòu)等將其劃分為A～J等10個(gè)亞群[1]。其中A亞群病毒是我國(guó)20世紀(jì)70年代雞場(chǎng)常見(jiàn)的外源性病毒，J亞型致瘤性較強(qiáng)，90年代曾在我國(guó)白羽肉雞和蛋用型雞中感染蔓延，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。經(jīng)過(guò)連續(xù)多年的檢疫和凈化，我國(guó)白羽肉雞和蛋用型雞的ALV感染得到有效控制，但地方品種雞群中ALV感染還很普遍，且呈一定的上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了地方雞種種質(zhì)資源的保護(hù)和利用[5-7]。

河南某斗雞原種場(chǎng)擁有2 400多羽原種公雞和12 000多羽原種母雞，受該場(chǎng)委托調(diào)查其核心種雞群的ALV感染狀況，于2017年1月-2018年7月期間，分別采集該場(chǎng)核心種雞群的雛雞胎糞、泄殖腔棉拭子、血清、精液等樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)該場(chǎng)ALV分離株進(jìn)行基因序列分析，明確了該場(chǎng)核心種群ALV的感染狀況，為該場(chǎng)建立禽白血病凈化措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 ALV-p27 ELISA檢測(cè)試劑盒為荷蘭Biochek公司產(chǎn)品，ALV-A/B、ALV-J亞型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)。DF-1細(xì)胞系由洛陽(yáng)普萊柯生物有限公司惠贈(zèng)。DMEM、胰酶和FBS為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。PCR引物由生工Sangon Biotech(武漢)公司合成。Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒和DNA Marker為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集 按照參考文獻(xiàn)[8-9]，分別6次采集某河南斗雞原種場(chǎng)核心雞群的雛雞胎糞、泄殖腔棉拭子、公雞精液等樣品。樣品基本信息見(jiàn)表1。每只雞都戴有腳號(hào)，對(duì)號(hào)采集樣品并進(jìn)行編號(hào)，低溫運(yùn)輸，及時(shí)檢測(cè)。

表1 采集樣品基本信息

1.3 ALV-A/B、J亞型抗體、p27抗原檢測(cè) 采用ELISA方法對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)。泄殖腔棉拭子和精液樣品進(jìn)行ALV-p27抗原檢測(cè)，檢測(cè)前反復(fù)凍融3次，離心取上清作為待檢樣品；血清樣品進(jìn)行ALV-A/B亞型、J亞型抗體檢測(cè)。

1.4 病毒分離鑒定 按照參考文獻(xiàn)[8]，將33份ALV-p27抗原陽(yáng)性的雞血漿0.5 mL分別接種于DF-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常DF-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。37 ℃孵育2h，吸棄血漿，加入含1% FBS的DMEM培養(yǎng)9 d。培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)凍融處理，離心，取100 μL細(xì)胞上清液進(jìn)行ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)，剩余細(xì)胞液用于提取ALV前病毒基因組。

1.5env基因的擴(kuò)增、測(cè)序和同源性分析

1.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照A亞型RSA株、J亞型HPRS103株、E亞型JS14Z01株的env序列，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增3個(gè)ALV亞型env基因的通用引物，上游：5′-AGACCTACCGTTCTTACAG-3′； 下游：5′-CCCTCCC-TATGCAAAAGC-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段約2 000 bp。

1.5.2env基因的擴(kuò)增和測(cè)序 取1.4制備的DF-1細(xì)胞，按照病毒DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，制備ALV前病毒DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增env基因。擴(kuò)增后采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將與目的片段大小一致的PCR產(chǎn)物送至生工Sangon Biotech(武漢)有限公司，進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.3 分離株env基因同源性分析 應(yīng)用Lasergene 7.0軟件，將該場(chǎng)分離的2株env基因核苷酸序列與參考毒株進(jìn)行同源性比對(duì)，分析env基因的變異情況，采用MEGA 6.0構(gòu)建ALV分離株env基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ALV-p27抗原、ALV- A/B、J亞型抗體檢測(cè)結(jié)果 各樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，由表可知，首次檢測(cè)時(shí)，該場(chǎng)核心雞群雛雞胎糞ALV-p27抗原檢出率為0，第二次檢測(cè)對(duì)象為核心群開(kāi)產(chǎn)母雞，其ALV-p27抗原陽(yáng)性率高達(dá)84.48%，ALV-A/B亞型抗體陽(yáng)性率為17.14%，未檢測(cè)到ALV- J亞型抗體。5個(gè)月后，該核心雞群的ALV p27抗原陽(yáng)性率升高至88.00%，且ALV-A/B亞型、J亞型抗體分別增至79.31%和24.14%。至2017年12月，核心群整體的ALV-p27抗原陽(yáng)性率為78.10%，7個(gè)月后，陰性留種公雞ALV-p27抗原陽(yáng)性率又升至9.52%。由此可知，該場(chǎng)核心雞群泄殖腔ALV-p27抗原陽(yáng)性率在檢測(cè)期內(nèi)持續(xù)在較高范圍內(nèi)，但抗體陽(yáng)性率在不同檢測(cè)時(shí)間的差別較大。該結(jié)果說(shuō)明該場(chǎng)核心群ALV-p27抗原陽(yáng)性率很高，血清抗體以ALV-A/B亞型為主。

2.2 病毒分離鑒定 33份泄殖腔棉拭子ALV-p27陽(yáng)性雞血漿，接種DF-1細(xì)胞，培養(yǎng)9 d后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清p27抗原ELISA檢測(cè)陽(yáng)性6份，占泄殖腔棉拭子ALV-p27陽(yáng)性群的18.00%。分離到的6株ALV分別命名為HNDJ1701-HNDJ1706。

表2 ALV- p27抗原、ALV- A/B、J亞型抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3env基因的擴(kuò)增和測(cè)序 以ALVenv基因通用引物對(duì)6份ALV前病毒env基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約2 000 bp的基因片段，與預(yù)期大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 env基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4env基因同源性分析 對(duì)分離自該場(chǎng)的2株分離株HNDJ1701和HNDJ1702的env基因進(jìn)行了基因序列比對(duì)，該場(chǎng)2株分離株的同源性為90.8%， HNDJ1701與國(guó)內(nèi)分離株ALV-A亞型SDAU09E2株、ALV-J亞型HPRS株的同源性分別為89.2%、56.4%，HNDJ1702與SDAU09E2株和HPRS株的同源性分別為89.2%和56.0%；HNDJ1701和HNDJ1702與國(guó)內(nèi)近年來(lái)報(bào)道的ALV-K亞型JS11C1株同源性均在88.00%以上，與國(guó)內(nèi)分離的ALV-E亞型JS14CZ01株和SD0501株的同源性分別為88.3%、88.3%和89.4%、90.5%(見(jiàn)圖2)。

運(yùn)用MEGA軟件繪制的ALV遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖3，可知該場(chǎng)HNDJ1701和HNDJ1702兩個(gè)分離株在同一分支，且與2009年國(guó)內(nèi)A亞型SDAU09E2H和K亞型JS11C1的所屬分支較近，但與J亞型早期分離株HPRS103及國(guó)內(nèi)近年來(lái)的J亞型分離株所屬分支親緣距離較遠(yuǎn)。

3 討論

與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)地方品種雞的抗病育種工作起步較晚，缺乏規(guī)模化養(yǎng)殖和規(guī)范的疫病監(jiān)控措施[10]。近年來(lái)，按照《我國(guó)中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2010-2020年)》要求，許多地方品種雞規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)始著手進(jìn)行相關(guān)疫病的檢疫和凈化工作。目前，禽白血病凈化過(guò)程中常用的ALV病毒ELISA檢測(cè)方法，可檢測(cè)泄殖腔棉拭子、胎糞、血清和蛋清等樣品中的ALV p27抗原含量，操作簡(jiǎn)單、快速，其中以泄殖腔樣品的采集最為簡(jiǎn)便、且檢出率較高[11]。監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，該核心雞群生產(chǎn)的第1批雛雞胎糞ALV-p27抗原陽(yáng)性率為0，但成年雞的ALV-p27抗原陽(yáng)性率高達(dá)80%以上。導(dǎo)致該結(jié)果的原因有：(1)雛雞胎糞樣品本身ALV-p27抗原的檢出率低，且抽檢樣品數(shù)量太少，不能反映核心群ALV感染狀況；(2)雖然2次隨機(jī)抽檢的陽(yáng)性雞已及時(shí)淘汰，但由于陽(yáng)性率高，而抽檢數(shù)量少，未淘汰所有陽(yáng)性雞；(3)種公雞血漿分離到外源ALV病毒，可能通過(guò)人工授精水平傳播導(dǎo)致ALV感染率高。

考慮到該場(chǎng)品種選育對(duì)核心種群數(shù)量的要求，不能簡(jiǎn)單采取淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27陽(yáng)性雞的凈化方法。從核心群ALV-p27抗原陽(yáng)性雞群隨機(jī)采集33份血漿，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果表明，外源性ALV分離率在泄殖腔棉拭子ALV-p27陽(yáng)性群體中占比為18%。該結(jié)果與前人的研究較為一致，即雞場(chǎng)在實(shí)施ALV凈化的初期不應(yīng)采用以泄殖腔ALV-p27抗原陽(yáng)性作為淘汰雞只的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樵趯?shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，臨床健康雞群的泄殖腔ALV-p27抗原陽(yáng)性最高可達(dá)30%，說(shuō)明存在較高的假陽(yáng)性[12]。因此，該場(chǎng)在ALV凈化初期，應(yīng)采血鑒定雞只是否感染外源性ALV作為淘汰雞只的標(biāo)準(zhǔn)，待擴(kuò)群數(shù)量可滿足育種需求時(shí)，再采集雛雞胎糞、血清等樣品進(jìn)行檢測(cè)，并提高凈化標(biāo)準(zhǔn)。

研究顯示，env基因是ALV致腫瘤的關(guān)鍵性基因，隨病毒適應(yīng)宿主而發(fā)生進(jìn)化時(shí)最易發(fā)生變異，近年來(lái)在凈化選擇壓力下，新分離ALV毒株env基因與早期分離株的同源性差異逐漸變大[13]。本研究中，隨機(jī)選取的2株分離株env基因同源性為90.5%，通過(guò)與國(guó)內(nèi)近年來(lái)各亞型分離株的序列比對(duì)表明，其在分支上基本歸屬于ALV-A亞型，與J亞型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明該場(chǎng)核心雞群存在一定的外源性ALV感染，且以A亞型為主。目前，未觀察到該核心雞群有明顯的腫瘤性疾病，這基本符合ALV-A亞型感染的臨床表現(xiàn)，如生長(zhǎng)緩慢、死亡率較高、產(chǎn)蛋量、孵化率和出雛率等生產(chǎn)性能低下[14]。該結(jié)果與目前我國(guó)地方品種雞群中的ALV流行趨勢(shì)較為一致[15-16]，也與該場(chǎng)目前未引進(jìn)外源品種進(jìn)行雜交的實(shí)際情況相符。隨著地方品種雞養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和雞群流動(dòng)性的增加，ALV-A在我國(guó)地方品種雞群中的流行傳播日趨嚴(yán)重，對(duì)地方品種資源保護(hù)造成較大威脅，應(yīng)盡快采取措施進(jìn)行ALV的檢測(cè)和凈化。

圖2 分離株與不同亞型ALV env基因核苷酸同源性比對(duì)

圖3 基于env基因的ALV核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)