張濤 張勝逆 李靖華 張愛民 楊季紅 程樹杰

先天性肛門直腸畸形(anorectal malformations，ARM)是小兒常見的消化道畸形，ARM發(fā)生的病理機制十分復(fù)雜，許多學者對動物和人類胚胎肛門直腸正常以及異常的發(fā)育過程進行了研究，目前仍沒有完全闡明正常肛門直腸胚胎發(fā)育的演變規(guī)律，對ARM具體的胚胎發(fā)生機制更是知之甚少［1－3］。胚胎期肛門直腸的形態(tài)演變和構(gòu)型改變依賴于細胞定向分化、增殖及細胞凋亡的協(xié)同作用。前人研究顯示，在小鼠肛門直腸的胚胎發(fā)育過程中，細胞增殖(凋亡)在泄殖腔分離、肛膜及尿生殖膜崩解中發(fā)揮了重要作用［4，5］。而細胞增殖(凋亡)是否也參與了人類肛門直腸的發(fā)育，至今未見相關(guān)研究報道。本研究應(yīng)用3～9周人胚標本，結(jié)合PCNA免疫組織化學及TUNEL技術(shù)染色分析細胞增殖(凋亡)的時空分布規(guī)律，初步探討細胞增殖(凋亡)在肛門直腸胚胎發(fā)育中的作用。旨在更深入地認識肛門直腸胚胎發(fā)育過程，為進一步闡明ARM的發(fā)生提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑 本研究遵守赫爾辛基宣言，收集因意外妊娠而進行人工流產(chǎn)，發(fā)育正常的人胚胎標本108例(每例標本均取得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)時間、Carnegie stages人胚胎形態(tài)發(fā)育特征和超聲所測胎兒頭臀長、雙頂徑等確定胎齡為3～9周。標本經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液4℃固定12～24 h，常規(guī)脫水制成蠟塊，行矢狀面連續(xù)切片。見表1。

表1 不同胎齡的標本分布

1.2 方法 3～5周胚胎取整個胚胎，6～9周胚胎取其盆部，標本經(jīng)0.01 mol/L PBS液沖洗后立即置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定12～24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。石蠟標本進行矢狀面連續(xù)切片，厚度4 μm，在顯微鏡下觀察未染色切片，在觀察到泄殖腔或直腸膀胱出現(xiàn)時連續(xù)保留切片，連續(xù)切片TUNEL和PCNA的免疫組化染色，免疫組化實驗采用SP法。Nikon E800成像系統(tǒng)拍照。采用NIS-Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)連續(xù)對比觀察不同胎齡人胚的泄殖腔、尿直腸隔、直腸、膀胱和尿道發(fā)育情況及其相互間的關(guān)系。對TUNEL、PCNA的表達進行定位觀察分析，每張切片分別觀察40倍，100倍及400倍視野圖像，來判定陽性細胞的分布區(qū)域及大體變化趨勢。

2 結(jié)果

2.1 凋亡細胞觀察 第6周，凋亡細胞主要位于肛門直腸、尿直腸隔及尿生殖竇的上皮;尤其是在肛門開口區(qū)周圍分布著大量凋亡細胞;第7周，凋亡細胞大量分布于直腸末端和直腸背側(cè)間質(zhì)區(qū);第8周，直腸及肛管上皮中可以見到凋亡細胞，而在尿直腸隔背側(cè)與泄殖腔膜內(nèi)僅觀察到少量的凋亡細胞。見圖1A～C。

圖1 胚胎6～8周時，凋亡細胞在肛門直腸區(qū)的時空分布特點:A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直腸隔;VCM，腹側(cè)泄殖腔膜;R，直腸;U，尿道(TUNEL染色，主圖×40，嵌圖×400)

圖2 胚胎6～8周時，增殖細胞在肛門直腸區(qū)的時空分布特點:A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直腸隔;VCM，腹側(cè)泄殖腔膜;R，直腸;U，尿道(PCNA免疫組化染色，主圖×40，嵌圖×400)

2.2 增殖細胞觀察 第6周，肛門直腸、尿生殖竇及尿直腸隔上可以觀察到微弱的增殖細胞;散在的增殖細胞位于背側(cè)泄殖腔膜;第7周，尿直腸隔間質(zhì)中可見增殖細胞出現(xiàn)，這些細胞大部分位于肛門直腸和尿直腸隔腹側(cè)的間質(zhì)內(nèi);第8周，增殖細胞主要分布于尿道和肛門直腸的上皮中，同時在尿直腸隔與腹側(cè)泄殖腔膜的融合區(qū)域內(nèi)有大量增殖細胞的聚集。見圖2A～C。

3 討論

ARM是小兒外科常見的先天性消化道畸形，其發(fā)生率1/5 000～1/1 500，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測的先天畸形之一。其病理類型極其復(fù)雜，從單純的肛門閉鎖到嚴重的泄殖腔畸形等，給患者帶來極大的痛苦，引起各國研究者的高度重視。在本研究中，我們通過連續(xù)動態(tài)觀察肛門直腸的發(fā)育過程，提出了一些新觀點，如尿直腸隔與泄殖腔膜的關(guān)系;背側(cè)及腹側(cè)泄殖腔膜分別與肛門直腸和尿生殖竇及會陰發(fā)育的關(guān)系;細胞凋亡(增殖)在肛門直腸發(fā)育中的時空分布特點等。

尿直腸隔與泄殖腔膜在泄殖腔向肛門直腸發(fā)育過程起到了重要的作用，而尿直腸隔是否與泄殖腔膜融合是目前爭論的焦點之一［4，5］。Van der Putte［6］通過對豬和人的胚胎形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn):泄殖腔分隔過程中，泄殖腔背側(cè)連同其間質(zhì)成份向尾溝移動，上皮細胞和泄殖腔膜向腹側(cè)延伸的同時，背側(cè)泄殖腔膜逐漸變薄破裂，形成肛門直腸對外界的開口。Kluth等［3］認為泄殖腔正常發(fā)生過程中產(chǎn)生了尿直腸隔這一結(jié)構(gòu)，但未觀察到尿直腸隔與泄殖腔膜的融合，并且強調(diào)在此過程中泄殖腔構(gòu)型變化的重要性。Paidas等［7］認為尿直腸隔與泄殖腔膜的距離的進行性減小是泄殖腔構(gòu)型變化的結(jié)果，伴隨著胚胎的生長、伸展、旋轉(zhuǎn)、尿直腸隔和泄殖腔膜距離不斷減小，未觀察到尿直腸隔和泄殖腔膜的融合。在本研究中，我們注意到肛門直腸的生長發(fā)育與其毗鄰組織的形態(tài)、空間位置之間存在密切聯(lián)系。本研究顯示胚胎3～5周，尿生殖竇周圍的間質(zhì)與肛門直腸區(qū)間質(zhì)的不對稱性發(fā)育，泄殖腔發(fā)生位置和構(gòu)象的重大改變;同時使得尿直腸隔在發(fā)育過程中不斷接近泄殖腔膜，其間隙變得越來越狹小。而在胚胎5～7周時，隨著背側(cè)泄殖腔向尾溝的不斷接近，泄殖腔逐漸縮小;背側(cè)泄殖腔膜在第7周時崩解，直腸自此與羊膜腔相通，這清楚的表明在人類胚胎肛門直腸發(fā)育過程中并未發(fā)現(xiàn)尿直腸隔與背側(cè)泄殖腔膜的融合。同時我們還發(fā)現(xiàn)，泄殖腔膜腹側(cè)部分較背側(cè)部分明顯為厚，此結(jié)果提示在泄殖腔膜的整個胚胎發(fā)育過程中存在著不均衡性的特點。由此我們推測，人胚泄殖腔的發(fā)育嚴格遵循時空動態(tài)變化的規(guī)律:在早期胚胎發(fā)育中，背側(cè)泄殖腔膜對于正常肛門直腸的發(fā)育發(fā)生發(fā)揮著極其重要的作用。

此外，在本研究中，還有一個現(xiàn)象值得密切關(guān)注:在背側(cè)泄殖腔膜崩解后，尿直腸隔進一步向頭側(cè)及腹側(cè)移位，向生殖結(jié)節(jié)延展，與腹側(cè)泄殖腔膜融合，直接參與了尿道近-遠軸的建立，其間質(zhì)參與了會陰體的形成。值得注意的是，到目前為止，盡管在泌尿生殖道研究領(lǐng)域有研究指出腹側(cè)泄殖腔膜參與了尿道的構(gòu)成，但是均未明確的指出腹側(cè)泄殖腔膜與尿直腸隔的融合這一重要現(xiàn)象［8－10］，使得人們忽視了腹側(cè)泄殖腔膜在參與泌尿生殖道構(gòu)成中所發(fā)揮的作用。這一發(fā)現(xiàn)提示腹側(cè)泄殖腔膜在泌尿生殖道和會陰的胚胎發(fā)育中具有重要意義，特別是在保持尿道完整性方面發(fā)揮了不可忽視的作用。本研究觀察到的現(xiàn)象對早期泄殖腔發(fā)育中存在長久爭議的事件提供了重要的形態(tài)學證據(jù)，進一步說明腹側(cè)和背側(cè)泄殖腔膜分別在正常的泌尿生殖系統(tǒng)和直腸發(fā)育中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

肛門直腸形成過程眾多生物學事件參與其中，如細胞分化，增殖，凋亡，轉(zhuǎn)化和粘附。在本研究中，我們首先探討肛門直腸發(fā)育中細胞凋亡所發(fā)揮的作用。第6周時，凋亡細胞主要分布于尿直腸隔背側(cè)間質(zhì)和背側(cè)泄殖腔膜，尿直腸隔間質(zhì)內(nèi)及泄殖腔膜的凋亡細胞背側(cè)部分比腹側(cè)部分明顯，而此時正是尿直腸隔頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)的關(guān)鍵時期，故推測尿直腸隔背腹側(cè)不均衡的細胞凋亡是導(dǎo)致尿直腸隔的頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)潛在機制之一。而尿直腸隔的頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)是泄殖腔構(gòu)型變化重要的一部分，是保證肛門直腸向尾溝下降的關(guān)鍵因素之一。在實驗中，我們同樣觀察到第6周時(圖4A)，在肛門開口區(qū)周圍分布著大量凋亡細胞，使得肛膜裂解，直腸與外界相通是凋亡作用的結(jié)果，基本與前人的研究［11，12］一致。第7周時，凋亡細胞大量分布于直腸末端和直腸背側(cè)間質(zhì)區(qū)，進一步證實在肛門直腸形成過程中凋亡的重要作用(圖4B)。從第8周，少量的凋亡細胞分布于尿直腸隔背側(cè)間質(zhì)，這可能與后期的尿直腸隔向頭腹側(cè)進一步旋轉(zhuǎn)密切相關(guān)(圖4C)?？傊毎蛲鲈诟亻T直腸的發(fā)育過程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，背側(cè)泄殖腔膜的凋亡與背側(cè)泄殖腔向肛門直腸發(fā)育存在密切的關(guān)系。

細胞增殖與凋亡相輔相成共同調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)生［11－13］。與 van der Putte［13－15］研究相比較，在本研究中，可以觀察到胚胎6～7周，尿直腸隔腹側(cè)增殖較背側(cè)顯著，促進了尿直腸隔向頭腹側(cè)的旋轉(zhuǎn)，泄殖腔膜也因此出現(xiàn)空間位置上從垂直位到水平位的轉(zhuǎn)化，引起了背側(cè)泄殖腔向尾溝的進一步接近。到胚胎第8周，增殖細胞集中出現(xiàn)于尿直腸隔腹側(cè)加快了其向頭腹側(cè)的旋轉(zhuǎn)，促進了與腹側(cè)泄殖腔膜的融合。所以我們認為:細胞增殖不但在肛門直腸發(fā)育中發(fā)揮了重大作用，而且對泌尿生殖道和會陰的胚胎發(fā)育也有重要的影響。我們推測，凋亡和增殖雙重作用參與了尾端器官的胚胎發(fā)生，也表明細胞凋亡和增殖異位分布可能會干擾正常肛門直腸和泌尿生殖道的發(fā)育。目前認為，在肛門直腸形成的關(guān)鍵時期眾多生物分子參與了細胞凋亡和增殖的調(diào)控，如 Wnt5a［16，17］、Shh 信號通路［18］、Hoxd-13［19］、Cdx1［20］以及 Tcf4［21］等均在胚胎發(fā)育時表達于背側(cè)泄殖腔膜上。在調(diào)控信號異常表達的情況下，背側(cè)泄殖腔膜在特定時間內(nèi)的細胞增殖、轉(zhuǎn)化和細胞凋亡發(fā)生紊亂，導(dǎo)致背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育不良，背側(cè)泄殖腔向尾溝的遷移發(fā)生障礙，從而引發(fā)ARM。

結(jié)合人類肛門直腸胚胎發(fā)育、ARM動物模型及臨床ARM的類型，我們綜合分析后提出，胚胎不同階段、泄殖腔及其毗鄰結(jié)構(gòu)的發(fā)育障礙/異常與ARM的嚴重程度和臨床類型存在一定聯(lián)系。肛門直腸畸形的胚胎發(fā)生和其他畸形的發(fā)生一樣，可能與妊娠期，特別是妊娠早期(4～12周)受到某些致畸因素如病毒感染、化學物質(zhì)、環(huán)境及營養(yǎng)等作用有關(guān)。胚胎期發(fā)生障礙的時間越早，所致畸形的位置越高、越復(fù)雜。若孕期干擾因素出現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期，可能會出現(xiàn)泄殖腔畸形、尾端發(fā)育不良等嚴重畸形;在胚胎5～8周時，背側(cè)泄殖腔膜發(fā)出異常的調(diào)控信號則可能使背側(cè)泄殖腔向腹側(cè)移位，將引起各型泌尿生殖道瘺，同時盆底肌發(fā)育缺陷也繼發(fā)出現(xiàn);若干擾因素出現(xiàn)在8周左右，則引發(fā)的畸形會相對較輕(肛門狹窄、肛門閉鎖等)。干擾因素出現(xiàn)于8周以后可能使得會陰及泌尿生殖道發(fā)育障礙，若尿直腸隔與腹側(cè)泄殖腔膜不能融合則可引起URSM畸形;腹側(cè)泄殖腔膜向尿道的延伸異常可能引起尿道下裂等畸形。由此我們認為，人胚泄殖腔發(fā)育嚴格遵循著時空動態(tài)變化的規(guī)律:在早期胚胎發(fā)育中，背側(cè)泄殖腔膜對于正常肛門直腸的發(fā)育發(fā)生發(fā)揮著極其重要的作用。然而由于孕期干擾因素的出現(xiàn)，胚胎發(fā)育缺陷，干擾了正常的背側(cè)泄殖腔及背側(cè)泄殖腔膜的發(fā)育，背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育異常，背側(cè)泄殖腔構(gòu)象異常，肛門直腸的開口位置異常，而異位的后腸開口位置的不同可能與背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育障礙的程度密切相關(guān)。背側(cè)泄殖腔膜及背側(cè)泄殖腔整體發(fā)育缺陷是ARM出現(xiàn)的形態(tài)學基礎(chǔ)，背側(cè)泄殖腔膜及背側(cè)泄殖腔的發(fā)育缺陷程度決定了ARM程度。

1 Sadler TW，Leland J，Susan L，et al.Langman’s medical embryology.10th edition.Philadelphia:Lippincott Williams ＆ Wilkins，2006.204-227.

2 Holschneider AM，Hutson JM.Anorectal malformations in children.New York:Springer，2006.31-42.

3 Kluth D，Hillen M，Lambrecht W.The principle of normal and abnormal hindgut development.J Pediatr Surg，1995，30:1143-1147.

4 Paidas CN，Morreale RF，Hutchins GM，et al.Normal and abnormal embryonic development of the anorectum in human embryos.Teratology，1998，57:70-78.

5 Penington EC，Hutson JM.The Absence of Lateral Fusion in Cloacal Partition.J Pediatr Surg，2003，38:1287-1295.

6 van der Putte SC.Normal and abnormal development of the anorectum.J Pediatr Surg，1986，21:434-440.

7 Paidas CN，Morreale RF，Hutchins GM，et al.Septation and differentiation of the embryonic human cloaca.J Pediatr Surg，1999，34:877-884.

8 Penington EC，Hutson JM.The urethral plate-does it grow into the genital tubercle or within it? BJU International，2002，89:733-739.

9 Hynes PJ，F(xiàn)raher JP.The development of the male genitourinary system:II.The origin and formation of the urethral plate.Br J Plastic Surg，2004，57:112-121.

10 Penington EC，Hutson JM.The cloacal plate:the missing link in anorectal and urogenital development.BJU International，2002，89:726-732.

11 Kubota Y，Shimotake T，Yanagihara J，et al.Development of anorectal malformations using etretinate.J Pediatr Surg，1998，33:127-129.

12 Qi BQ，Williams A，Beasley S，et al.Clarification of the process of separation of the cloaca into rectum and urogenital sinus in the rat embryo.J Pediatr Surg，2000，35:1810-1816.

13 van der Putte SCJ.The development of the perineum in the human.A comprehensive histological study with a special reference to the role of the stromal components.Adv Anat Embryol Cell Biol，2005，177:1-131.

14 van der Putte SCJ.The development of the human anorectum.Anat Rec，2009，292:951-954.

15 Van der Putte SCJ.Anal and ano-urogenital malformations:a histopathological study of“imperforate anus”with a reconstruction of the pathogenesis.Pediatr Dev Pathol，2006，9:280-296.

16 Tai CC，Sala FG，Bellusci S，et al.Wnt5a knock-out mouse as a new model of anorectal malformation.J Surg Res，2009，156:278-282.

17 Nakata M，Takada Y，Yoshida H，et al.Induction of Wnt5a-expressing mesenchymal cells adjacent to the cloacal plate is an essential process for its proximodistal elongation and subsequent anorectal development.Pediatr Res，2009，66:149-154.

18 Seifert AW，Harfe BD，Cohn MJ.Cell lineage analysis demonstrates an endodermal origin of the distal urethra and perineum.Dev Biol，2008，318:143-152.

19 Fritsch H，Aigner F，Longato S，et al.Epithelial and Muscular Regionalization of the Human Developing Anorectum.Anat Rec，2007，290:1449-1458.

20 Zhang T，Bai YZ，Wang WL et al.Temporal and spatial expression of caudal-type homeobox gene-1 in the development of anorectal malformations in rat embryos.J Pediatr Surg，2009，44:1568-1574.

21 Zhang T，Bai YZ，Wang WL，et al.Spatiotemporal pattern analysis of transcription factor 4 in the developing anorectum of the rat embryo with anorectal malformations.Int J Colorectal Dis，2009，24:1039-1047.