胡 波 ， 范志宇 ， 魏后軍 ， 仇汝龍 ， 陳萌萌 ， 宋艷華 ， 朱偉峰 ， 徐為中 ， 王 芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 江蘇 南京 210014)

Keap1-Nrf2-ARE是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化應(yīng)激通路，其可調(diào)節(jié)各種內(nèi)外環(huán)境引發(fā)的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞受到的氧化損傷[1]。Keap1是Nrf2蛋白的主要抑制因子，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的感受器[2]，其與Nrf2蛋白的互作對(duì)抗氧化應(yīng)激通路的調(diào)控具有重要作用[3-4]。病毒感染、炎癥等許多疾病的發(fā)生發(fā)展均與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5-6]，但到目前為止，兔作為一種廣泛用于病理學(xué)、生理學(xué)及免疫學(xué)等研究的試驗(yàn)動(dòng)物，其抗氧化應(yīng)激通路關(guān)鍵基因的表達(dá)水平仍缺乏相應(yīng)的檢測(cè)手段，而Keap1、Nrf2等基因的表達(dá)水平反映了該通路的激活或抑制情況。此外，Keap1也是一種腫瘤抑制因子，其能結(jié)合并促進(jìn)致癌酶IKK的泛素化降解，且Keap1基因的表達(dá)水平與病人死亡率直接相關(guān)[7]。本試驗(yàn)以新西蘭兔為對(duì)象，建立了兔Keap1基因熒光定量PCR檢測(cè)方法，為研究兔Keap1基因的表達(dá)調(diào)控及在相關(guān)疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和工具酶 RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix ExTaqⅡ、pMD-19T載體、T4 DNA連接酶、核酸凝膠回收試劑盒,購(gòu)自TaKaRa公司；DEPC水,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker DL-2 000、1.1×Pfu Master Mix,購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 2月齡健康新西蘭母兔2只，購(gòu)自金陵種兔場(chǎng)，耳靜脈空氣針處死后，分別采集心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，置于-80 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中穴兔Keap1基因序列(NO.XM008251548)，利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Keap1基因C端的引物和檢測(cè)Keap1基因的特異性鑒定引物(表1)，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 兔Keap1基因引物序列

1.4 RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso Plus提取兔心、肝、脾、肺、腎、腦等組織懸液的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備 以Keap1C-F和Keap1C-R為上下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、回收、連接及轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-19T-Keap1C。反應(yīng)體系：cDNA 4 μL，Pfu Master Mix 44 μL，10 μM上、下游引物各1 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段回收、純化，并克隆入pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落，送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 測(cè)定pMD-19T-Keap1C質(zhì)粒濃度并10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，按羅氏480 PCR儀的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：TB GreenTMPremix ExTaq10 μL，10 μM上、下游引物各0.8 μL，質(zhì)粒模板 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。以模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 敏感性和重復(fù)性檢測(cè) 以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR和普通PCR，檢驗(yàn)方法的敏感性。將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算組間和組內(nèi)變異系數(shù)，分析方法的重復(fù)性。

1.7Keap1在兔組織中的含量檢測(cè) 以2只新西蘭兔不同組織提取的cDNA為模板，兔β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并采用2-ΔΔCt算法，計(jì)算Keap1在兔不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1Keap1基因擴(kuò)增及陽(yáng)性質(zhì)粒的制備 以TRIzol法提取新西蘭兔肝臟的總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增Keap1基因C端。結(jié)果顯示，獲得大小約600 bp的特異性條帶(圖1)。經(jīng)回收純化并連接pMD-19T載體后，挑取陽(yáng)性菌落測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)，所擴(kuò)增的Keap1基因C端序列與GenBank上穴兔Keap1基因序列的同源性為100%，表明陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-19T-Keap1C制備成功，經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒濃度為5.28×1011拷貝/μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-19T-Keap1C進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)圆煌瑵舛鹊馁|(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品稀釋度做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，新西蘭兔Keap1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，y=-3.174x+39.69，R2=0.999 2(圖2)，擴(kuò)增效率為103%。

圖2 新西蘭兔Keap1基因標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)

2.3 敏感性檢驗(yàn) 用建立的熒光定量PCR方法對(duì)10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性是普通PCR方法的1 000倍(圖3)。

圖3 新西蘭兔Keap1基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR(A)和普通PCR(B)檢測(cè)

2.4 重復(fù)性檢驗(yàn) 將6個(gè)不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.28×109～5.28×104拷貝/μL)重復(fù)檢測(cè)3次，并于不同時(shí)間再分別檢測(cè)3次。經(jīng)計(jì)算，組內(nèi)變異系數(shù)CV為0.2%～1.1%，組間變異系數(shù)CV為1.3%～3.7%。

2.5Keap1基因在兔不同組織中的表達(dá)差異分析 用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)2月齡新西蘭兔各組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，Keap1和β-actin的熔解曲線為單峰，特異性良好(圖4)。Keap1 mRNA在兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦中均可檢測(cè)到，且在肝臟中表達(dá)最高，在脾臟中表達(dá)最低。經(jīng)GraphPad Prism 5軟件單因素方差分析，相對(duì)于Keap1基因在脾臟的表達(dá)水平，Keap1在心臟和腎臟的表達(dá)水平與脾臟之間存在顯著差異(P<0.05)，Keap1在肝臟、肺臟和腦的表達(dá)水平與脾臟之間存在極顯著差異(P<0.01)(圖5)。

3 討論

活性氧(ROS)自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激涉及到多種疾病的病理過(guò)程。Keap1是調(diào)控抗氧化應(yīng)激通路中Nrf2活性的主要分子。當(dāng)機(jī)體遭遇病毒感染、重金屬暴露等各種內(nèi)外環(huán)境刺激后產(chǎn)生大量ROS，使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并入核，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在砷引起中毒的研究中，砷暴露引起機(jī)體Keap1表達(dá)下調(diào)和Nrf2表達(dá)上調(diào)，從而影響機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[10]。在乳腺癌研究中，Keap1的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了IKK的降解，提高了病人的存活率[7]。另外，Keap1-Nrf2-ARE和NF-κB這兩條細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路共同參與多個(gè)生物反應(yīng)進(jìn)程，它們之間相互關(guān)聯(lián)和影響。據(jù)報(bào)道，Keap1是聯(lián)系兩條信號(hào)通路的直接信號(hào)分子，NF-κB通路中的p65可以增強(qiáng)Keap1的穩(wěn)定性從而增強(qiáng)對(duì)Keap1-Nrf2-ARE通路的抑制作用[11]，而Keap1也能抑制NF-κB信號(hào)通路[7]?？梢?jiàn)，Keap1的表達(dá)水平對(duì)機(jī)體抗氧化應(yīng)激通路和NF-κB通路的活性均有重要意義。

圖4 熔解曲線分析

圖5 Keap1 mRNA在新西蘭兔不同組織中的表達(dá)情況

本試驗(yàn)建立了Keap1基因的熒光定量PCR方法，并通過(guò)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增得到了良好的S型曲線。熔解曲線分析顯示擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度均一，平均為90 ℃左右。所建立的方法具有良好的敏感性和重復(fù)性，可檢測(cè)到濃度為52.8拷貝/μL的樣品，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于5%。對(duì)新西蘭兔不同組織mRNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Keap1基因在肝臟中表達(dá)最高，在脾臟中表達(dá)最低，這可能與各組織不同的生理功能有密切關(guān)系。本試驗(yàn)建立了新西蘭兔Keap1基因熒光定量PCR檢測(cè)方法，并檢測(cè)了其在新西蘭兔各組織中的表達(dá)差異，為以新西蘭兔作為研究對(duì)象或模型動(dòng)物的抗氧化應(yīng)激相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。