郭佳禾 ， 唐 程 ， 王夢(mèng)琦 , 倪 煒 , 張慧敏 , 李明勛 , 楊章平 , 毛永江

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害最大的疾病之一。目前，全世界約有2.2億頭奶牛，其中1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎，每年因乳房炎而造成的損失高達(dá)350億美元，僅美國(guó)的損失就達(dá)20億美元[1-2]。引起乳房炎的致病微生物復(fù)雜多樣，且具有顯著的地區(qū)差異性。

奶牛乳房炎是乳腺組織受到外界刺激(物理、化學(xué)、微生物等)所發(fā)生的一種炎癥變化，是一種多因素疾病。其中微生物是引發(fā)奶牛乳腺炎的主要

因素，多種非特定的病原微生物均能引起奶牛乳腺炎，較常見的是金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌[3]。在臨床中，往往是2種或2種以上的病原微生物共同作用于機(jī)體，呈現(xiàn)混合感染[4]。乳房炎不僅會(huì)導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，而且會(huì)導(dǎo)致奶牛體細(xì)胞數(shù)顯著上升，乳糖率下降，牛奶品質(zhì)嚴(yán)重降低[5]。

臨床上主要采用抗生素對(duì)乳房炎進(jìn)行治療，常發(fā)生抗生素濫用、休藥不規(guī)范等情況，導(dǎo)致生產(chǎn)的奶產(chǎn)品中抗生素的含量超標(biāo)，危害了人民的身體健康，從而引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問題，同時(shí)主要致病菌的耐藥性也在逐年上升[6-8]。

為了研究江蘇地區(qū)奶牛乳腺炎的致病菌類型以及主要致病菌對(duì)臨床常用藥物的耐藥性，本文對(duì)江蘇地區(qū)某奶牛場(chǎng)患有乳房炎的致病菌進(jìn)行分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，分析不同細(xì)菌的耐藥抗生素及敏感性，以期為臨床用藥以及合理利用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、綿羊鮮血、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、藥敏試紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司； 2×PCR Solution PremixTaqTM，購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖，TAE溶液，核酸染色劑，擎科250 bp DNA Ladder 。試驗(yàn)材料及設(shè)備：PCR管、離心機(jī)、PCR儀，離心機(jī)、凝膠電泳儀。

1.2 乳樣采集 2016年6月-7月采集江蘇地區(qū)某大型奶牛場(chǎng)采集中國(guó)荷斯坦牛奶樣633份。采取奶樣前棄去頭3把乳，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?牧場(chǎng)基本情況如下：全場(chǎng)共有奶牛10 000余頭，其中成年泌乳奶牛近6 000頭，散欄飼養(yǎng)，魚骨式擠奶大廳進(jìn)行擠奶，日擠奶3次，采用全混合日糧(Total Mixed Ration, TMR)飼喂。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 將奶樣取出后置于室溫解凍。輕搖混勻乳樣，取100 μL乳樣接種于鮮血瓊脂平板。每份乳樣接種3塊平板，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)特征。挑取典型菌落涂片，革蘭染色，鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及革蘭染色特性初步判定細(xì)菌類屬[8]。

1.3.1 鏡檢及生化鑒定 金黃色葡萄球菌鑒定：鏡檢形態(tài)符合葡萄球菌特性，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和血液瓊脂平板形成圓形、金黃色、灰白色或檸檬色菌落，且接觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)陽性的細(xì)菌，即初步鑒定為金黃色葡萄球菌。凝固酶陰性球菌鑒定：鏡檢形態(tài)符合球菌特性，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和血液瓊脂平板形成白色菌落，且接觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)陰性的細(xì)菌，即鑒定初步為凝固酶陰性球菌。大腸桿菌鑒定：革蘭陰性桿菌氧化酶試驗(yàn)陰性，在麥康凱瓊脂平板形成粉紅色，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板形成紫黑色帶金屬光澤菌落，在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，不分解尿素，即初步鑒定為大腸埃希菌。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 采用 PCR擴(kuò)增以及測(cè)序驗(yàn)證細(xì)菌種屬，用無菌牙簽挑取單個(gè)菌落到0.2 mL PCR管中，加入10 μL無菌1×TE緩沖液混勻(可用戴手套的手指彈擊離心管)，標(biāo)記，蓋緊，100 ℃煮沸5 min，-20 ℃冷凍5 min(循環(huán)2次)，5 000 r/min離心1 min，吸取8 μL上清液作為PCR擴(kuò)增的DNA模板，采用50 μL反應(yīng)體系。體系組份和含量為DNA模板8 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，上游引物(25 μmol/L)2 μL ，下游引物(25 μmol/L)2 μL ，Taq酶(每微升含2單位)2 μL ，去離子水30 μL。PCR參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min；主循環(huán)：94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 循環(huán)30次； 終延伸72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

電泳采用1×TAE緩沖液配制質(zhì)量濃度為0.1 g/L的瓊脂糖凝膠，加EB(熒光素，溴化乙錠)至終濃度為0.5 μg/mL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6倍載樣緩沖液混合，每個(gè)樣品加樣10 μL，10 V/cm電泳40 min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行，分離菌純化后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。分別取經(jīng)鑒定的各個(gè)培養(yǎng)基上的菌落，作密集劃線分別接種于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上，用小鑷子夾取抗菌藥物紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后取出。用卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑(包括藥敏紙片直徑)，直徑小于10 cm為耐藥；10～15 cm之間為中度敏感；大于15 cm為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離以及鑒定 從577份樣品中分離出636株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢以及PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序等試驗(yàn)，鑒定出凝固酶陰性葡萄球菌176株，占分離菌的27.67%；大腸桿菌268株，占分離菌的42.14%；凝固酶陽性葡萄球菌(金黃色葡萄球菌)93株，占分離菌的14.63%；其他菌占15.56%。其中單一感染574份，混合感染的樣品62份，混合感染的比率為9.75%。見表1及表2。

表1 奶牛乳房炎分離病原菌的數(shù)量

2.2 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)乳樣中分離出的細(xì)菌種類進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，因?qū)嶋H條件所限，不同藥物所對(duì)應(yīng)細(xì)菌的樣本量不同，后面所有結(jié)論均根據(jù)各敏感程度的細(xì)菌占總樣本量的百分比得出。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：凝固酶陰性球菌對(duì)于環(huán)丙沙星、慶大霉素、諾佛沙星、恩諾沙星等藥物敏感，其中度敏感以上菌株比例為96.2%、83.1%、85.7%、90.5%,對(duì)其他常規(guī)抗生素均存在不同程度的耐藥。凝固酶陽性球菌對(duì)氨芐西林，環(huán)丙沙星、慶大霉素、諾氟沙星、恩諾沙星等藥物敏感,其中度敏感以上菌株比例為82.8%、96.2%、83.7%、85.7%、85.1%；對(duì)于鏈霉素和青霉素低敏,其中度敏感以上菌株比例為53.8%、47.0%；大腸桿菌對(duì)于環(huán)丙沙星、慶大霉素敏感,其中度敏感以上菌株比例為96.9%、78.1%；對(duì)于鏈霉素和紅霉素則表現(xiàn)為耐藥,其中度敏感以上菌株比例為37%、15%。見表3。

3 討論

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，凝固酶陰性球菌對(duì)于喹諾酮類藥物敏感性好，而對(duì)紅霉素和青霉素等其他常規(guī)藥物耐藥明顯，根據(jù)本牧場(chǎng)的結(jié)果,臨床上對(duì)凝固酶陰性球菌感染的乳房炎應(yīng)該首選氟喹諾酮類藥物進(jìn)行治療；凝固酶陽性葡萄球菌對(duì)大部分抗生素的敏感性良好；大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感性良好，但同樣對(duì)鏈霉素和紅霉素呈現(xiàn)出明顯的耐藥，臨床上應(yīng)盡量減少鏈霉素和紅霉素的使用。

多種病原微生物可誘發(fā)奶牛乳腺炎。目前為止，已報(bào)道的奶牛乳房炎病原微生物至少有150種，主要為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌等[9]。隨著乳腺炎藥物治療的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重。如某些細(xì)菌中的mecA(耐甲氧西林葡萄球菌攜帶的耐藥基因)可以使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，mecA基因經(jīng)RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生一種與蛋白PBP2a(青霉素結(jié)合蛋白)，其特性是對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素類、頭孢菌素類和單酰胺類)的親合力降低，從而產(chǎn)生耐藥[10]。

在分析北京、內(nèi)蒙古、金華、魯西等地區(qū)牧場(chǎng)所做藥敏試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以看到不同地區(qū)的牧場(chǎng)主要奶牛乳房炎致病菌存在差異，并且不同地區(qū)相同細(xì)菌對(duì)同種藥物耐藥性也不完全相同，這表明乳房炎致病菌及其耐藥性存在地區(qū)差異[11-14]。并且這4個(gè)地區(qū)主要感染菌中都存在金黃色葡萄球菌，并且其藥敏結(jié)果與本文結(jié)果基本一致 。

在前人研究結(jié)果表明：凝固酶陰性球菌所占比重非常小甚至沒有[15]。而本試驗(yàn)中分離的凝固酶陰性球菌(CNS)卻占到了27.67%,并且混合感染的類型多為CNS/E.coli。CNS占比的升高主要是因?yàn)榍嗝顾氐瓤股氐膹V泛使用以及人為的因素造成的抗生素的不合理使用使得耐藥微生物不斷的增多。

如何選用最佳的藥物治療乳房炎也就成為了人們研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘇北地區(qū)各類凝固酶陰性球菌與凝固酶陽性球菌和大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物均為敏感，治療效果較好。但氟喹諾酮類藥物在臨床使用中存在著藥物殘留的問題。給乳牛靜脈注射2.5 mg/kg·bw恩諾沙星，恩諾沙星在體內(nèi)很快被代謝為環(huán)丙沙星，后者在乳汁存留較長(zhǎng)時(shí)間[16]。所以對(duì)于用氟喹諾酮類藥物治療的乳牛，一定要遵守休藥期的時(shí)間。喹諾酮類藥物殘留不僅可以直接對(duì)人體產(chǎn)生急慢性毒性作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，還可以通過環(huán)境和食物鏈的作用間接對(duì)人體健康造成潛在危害，影響我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和走向國(guó)際市場(chǎng)。

江蘇地區(qū)某奶牛場(chǎng)主要乳房炎致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性球菌，其凝固酶陰性球菌的感染率高于周邊地區(qū)。該牛場(chǎng)主要致病菌對(duì)青霉素、紅霉素、鏈霉素低敏，對(duì)喹諾酮類藥物高敏。