陳芳梅 李 偉 劉 蔚 于源華 王子琛 張鵬宇 張貴林

(長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022)

腸道菌群數(shù)量龐大，整個(gè)基因總數(shù)約為人類的150倍， 近年來，隨著“人類微生物組計(jì)劃”、“腸道元基因組計(jì)劃”等研究項(xiàng)目的開展，人類對(duì)腸道菌群的關(guān)注達(dá)到了空前的高度[1-3]。 隨著對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的不斷探索，人們發(fā)現(xiàn)腸道菌群與宿主健康密切相關(guān)，被認(rèn)為是人體的“微生物器官”[4]。已有研究結(jié)果表明腸道微生物與肝硬化、肥胖、艾滋病，甚至是心理疾病的發(fā)生都有密切的關(guān)系[5-8]。腸道微生物與宿主之間存在著腸道微生態(tài)平衡，這種平衡一旦被打破，宿主就極易遭受各種疾病的困擾[9]。深入研究腸道微生物與腸道微生態(tài)平衡對(duì)促進(jìn)人體健康以及人類和動(dòng)物疾病防治等具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)研究生存環(huán)境差異極大的兩種動(dòng)物腸道不同部位中微生物的分布情況，為更深入地研究腸道健康與腸道微生物的關(guān)系以及為本課題組的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽魚(423～490)g，成年雄魚，夏季，氣溫15～30 ℃，研究對(duì)象與本課題組的腸道微生物組學(xué)研究保持一致，購(gòu)買自吉林省長(zhǎng)春市新立城彥軒養(yǎng)殖場(chǎng)。

SD 大鼠(144～164)g，7周齡，雄性，清潔級(jí)，購(gòu)買自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(遼)2015-0001)。

1.2 試劑

大腸桿菌選擇培養(yǎng)基(EMB)、卡那霉素ELB選擇培養(yǎng)基[10]、乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基(Lbs)、雙岐桿菌選擇培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng)基，膽汁-七葉苷培養(yǎng)基，快速革蘭染色液等，購(gòu)買自寶泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

小型高速冷凍離心機(jī)(5424R)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)、電子顯微鏡(CX40)、氣浴恒溫振蕩器(THZ-92A)、50 mL容量離心機(jī)(1736R)等。

1.4 方法

1.4.1腸道內(nèi)容物的獲取和菌液制備: 隨機(jī)選取3只SD大鼠處死，消毒后置于超凈臺(tái)，取出空回腸、盲腸以及結(jié)腸的腸道內(nèi)容物各1 g，根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[11]制備腸道菌液。

隨機(jī)選取3條鯽魚處死，消毒后置于超凈臺(tái)，取出前腸、中腸 以及后腸的腸道內(nèi)容物各1 g，根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[11]制備腸道菌液。

1.4.2菌液稀釋與平板計(jì)數(shù): 各段腸道每克內(nèi)容物菌液稀釋倍數(shù)分別是：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,涂布于各選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)。37 ℃恒溫培養(yǎng)，雙歧桿菌、乳酸桿菌37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，腸球菌、大腸桿菌37 ℃好氧培養(yǎng)24 h。長(zhǎng)菌后通過菌落形態(tài)、革蘭染色、鏡檢以及各種生化反應(yīng)等鑒定，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算每克濕腸道內(nèi)容物中的菌數(shù)，即CFU/g標(biāo)本。

公式:CFU/g標(biāo)本=X×10×稀釋倍數(shù)，(X表示計(jì)數(shù)平板菌落平均數(shù))

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 菌落鑒定

通過對(duì)平板菌落特征、菌落形態(tài)、生化反應(yīng)以及革蘭染色后(如圖1和圖2)，確定所培養(yǎng)菌群為雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和大腸桿菌。

圖1 部分平板培養(yǎng)圖注：A:雙歧桿菌；B：乳酸桿菌；C：腸球菌；D：大腸桿菌Fig.1 Part of the plate culture diagramNote: A:Bifidobacterium; B:Lactobacillus; C: Enterococcus; D:Escherichia coli

圖2 革蘭染色結(jié)果 ×1000注：A:雙歧桿菌；B：乳酸桿菌；C：腸球菌；D：大腸桿菌Fig.2 Gram staining results ×1000 Note: A:Bifidobacterium; B:Lactobacillus; C: Enterococcus; D:Escherichia coli

2.2 數(shù)據(jù)分析

大鼠不同腸段的同種菌群相比，厭氧菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌)沿腸道向下數(shù)量遞增，且有顯著差異(P<0.05)。需氧菌(腸球菌、大腸桿菌)在盲腸內(nèi)的數(shù)量較其它腸段多，且有顯著差異(P<0.05)。各腸段總菌數(shù)也沿腸道向下依次遞增。表1中不同菌群的同腸段相比，各腸段中，厭氧雙歧桿菌數(shù)量最多，其次為厭氧乳酸桿菌，二者與大腸桿菌、腸球菌數(shù)量相比有顯著差異(P<0.05)。在整個(gè)腸道中厭氧的雙歧桿菌、乳酸桿菌總數(shù)比腸球菌、大腸桿菌總數(shù)高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，見表1。

鯽魚不同腸段的同種菌群相比，雙歧桿菌、腸球菌以及大腸桿菌數(shù)量沿腸道向下增加。各腸段總菌數(shù)沿腸道向下也依次遞增。表2不同菌群的同腸段相比，各腸段中，厭氧的雙歧桿菌數(shù)量最多，比需氧的大腸桿菌、腸球菌數(shù)量高出1～2數(shù)量級(jí)，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同為厭氧的乳酸桿菌數(shù)量卻比需氧大腸桿菌小1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，與腸球菌相比，除中腸段數(shù)量相差最小，其余腸段也小1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。整個(gè)鯽魚腸道中各菌群總數(shù)從多到少依次為雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌以及乳酸桿菌，且厭氧菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌)總數(shù)也大于需氧菌(腸球菌、大腸桿菌)總數(shù)，見表2。

表1 SD大鼠腸道菌群計(jì)數(shù)(菌落計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為lg 值，Table 1 Intestinal microflora count in SD rats(Colony count was converted to lg

注：如果數(shù)據(jù)在同一行或同一列中用不同的字母表示(a,b,c，d)，則存在顯著性差異(P<0.05)，如果同一行或同一列中有相同的字母表示(a,b,c，d)，則沒有顯著差異(P>0.05)

Note: There is significant difference (P<0.05) if the data are labeled with different letters (a,b,c，d), and no significant difference (P> 0.05) if with the sameletters (a,b,c，d) in the same line or in the same column

腸段雙歧桿菌乳酸桿菌腸球菌大腸桿菌總計(jì)前腸7.337±0.127a3.709±0.066b5.002±0.065c5.326±0.064d7.354中腸7.392±0.139a5.466±0.093d5.118±0.069b6.493±0.071c7.463后腸8.044±0.070c5.379±0.051d6.072±0.042a6.853±0.029b8.080總計(jì)8.2035.7336.1517.0218.235

注：如果數(shù)據(jù)在同一行或同一列中用不同的字母表示(a,b,c，d)，則存在顯著性差異(P<0.05)，如果同一行或同一列中有相同的字母表示(a,b,c，d)，則沒有顯著差異(P>0.05)

Note: There is significant difference (P<0.05) if the data are labeled with different letters (a,b,c,d), and no significant difference (P>0.05) if with the sameletters (a,b,c，d) in the same line or in the same column

在大鼠、鯽魚腸道中，厭氧的雙歧桿菌所占比例最多，且在鯽魚腸道中雙歧桿菌所占比例(92.76%)遠(yuǎn)高于大鼠腸道中的相應(yīng)比例(66.24%)。而同為厭氧菌的乳酸桿菌在鯽魚腸道中的比例(0.32%)遠(yuǎn)低于大鼠腸道中的比例(33.61%)。鯽魚腸道中的需氧菌(腸球菌和大腸桿菌)在腸道總菌中所占的比例也遠(yuǎn)高于大鼠腸道中的比例，見表3。

表3 大鼠和鯽魚腸道微生物分布比例(%)Table 3 Distribution of intestinal microflora in rats and crucian carp(%)

3 討論

已有研究表明腸道微生物在腸道不同區(qū)域的分布有所不同，以便適應(yīng)不同腸段的環(huán)境或者促進(jìn)其功能[12-13]。因此將大鼠和鯽魚腸道進(jìn)行分段取樣，發(fā)現(xiàn)大鼠空回腸及鯽魚前腸段的各菌總數(shù)最少，盲腸及中腸次之，而結(jié)腸和后腸段各菌總數(shù)最高，這一結(jié)果與之前的研究是一致的，即腸道中微生物的密度沿腸道向下是逐漸增加的[14-15]。

實(shí)驗(yàn)將鯽魚和大鼠腸道中各菌總數(shù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大鼠腸道中乳酸桿菌所占比重遠(yuǎn)高于鯽魚腸道，同時(shí)大鼠腸道中雙歧桿菌、腸球菌以及大腸桿菌所占比重都明顯小于鯽魚腸道。這可能是乳酸桿菌引起的，乳酸桿菌作為腸道益生菌之一，有研究表明乳酸桿菌的分泌產(chǎn)物能改變革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞膜的通透性從而抑制陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，同時(shí)降低腸道pH，抑制大腸桿菌及梭菌等的生長(zhǎng)[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中鯽魚腸道中乳酸桿菌數(shù)量與尹軍霞等[17]發(fā)表的結(jié)果有一定差異，這可能因?yàn)闇囟鹊脑?。已有研究表明鯽魚腸道內(nèi)的乳酸桿菌也會(huì)因季節(jié)變化而發(fā)生改變，主要是與溫度有關(guān)。

無論陸生哺乳動(dòng)物大鼠，還是淡水卵生動(dòng)物鯽魚，其各腸段中有益菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)的總數(shù)量都要明顯高于條件致病菌(腸球菌和大腸桿菌)的總數(shù)量。鯽魚、大鼠整個(gè)腸道中需氧的腸球菌的數(shù)量級(jí)相當(dāng)。大鼠、鯽魚腸道中雙歧桿菌的數(shù)量沿著腸道向下是逐漸增加的，腸道總菌數(shù)也沿腸道向下逐漸增加。大鼠腸道中只有乳酸桿菌所占比重高于鯽魚腸道，其余菌落(雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌)比重都明顯小于鯽魚腸道。通過本實(shí)驗(yàn)揭示了不同動(dòng)物的不同腸段中腸道微生物的分布呈現(xiàn)各自的規(guī)律，為深入研究腸道健康與腸道微生物之間關(guān)系提供理論信息。