桂 飛 楊偉偉 俞利平 戴方偉 杜江濤 宋曉明

(1. 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310036)(2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310013)

小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，基因組為線性不分段的單股正鏈RNA[1]。MHV感染是一種嚴(yán)重危害小鼠生產(chǎn)的病毒性傳染病，不僅嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，還對(duì)科學(xué)研究結(jié)果造成潛在的干擾，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。正常情況下呈隱性感染，應(yīng)激激發(fā)時(shí)會(huì)誘發(fā)致死性病變，是一種廣泛傳播且頑固的病原，也是國(guó)標(biāo)GB 14922.2《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及檢測(cè)》[2]中所需排除的病原之一。近年來(lái)，隨著遺傳工程小鼠制備技術(shù)的迅速發(fā)展，攜帶MHV的遺傳工程小鼠在不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施間被廣泛交流和傳播，且難于被發(fā)現(xiàn)和有效控制，MHV已是遺傳工程小鼠微生物控制中最難于生物凈化的病原之一[3]，因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)MHV是有效防制該病的前提，加強(qiáng)對(duì)MHV診斷的研究對(duì)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量具有重要意義。

MHV的診斷方法有病毒分離與鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)、組織病理學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)[4-5]即為其中一種。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但影響其檢測(cè)效果的因素有很多，除引物序列、反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件等，病毒RNA的提取效率也十分關(guān)鍵。本研究針對(duì)市售的6種病毒RNA提取試劑盒開展提取效率、操作簡(jiǎn)便性及重復(fù)性等比較，探索更有效的糞便病毒核酸提取方法，為提高M(jìn)HV的分子生物學(xué)檢測(cè)準(zhǔn)確性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 14只6～8周齡C57BL/6小鼠，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(浙)2016-0004，經(jīng)PCR鑒定為MHV陽(yáng)性。小鼠飼養(yǎng)在隔離器中，每籠飼養(yǎng)1只，使用許可證：SYXK(浙)2016-0006，自由采食和飲水。

1.1.2試劑: TIANamp RNA Kit for Virus Detection(TIANGEN SD101)、DNA/RNA Isolation Kit(TIANGEN DP422)核酸提取試劑盒以及Fast Quant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN KR106)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN 52904)購(gòu)自QIAGEN公司；Power Microbiomewer MicrobioNA Mini(MO BIO 26000)購(gòu)自深圳安必勝生物技術(shù)有限公司；MagMAX必勝生物技術(shù)有限公司；Mini Kit Detection 酸提取方法(ABI AM1840)以及TaqMan? Gene Expression Master Mix(ABI 4369016)購(gòu)自ABI公司；小鼠肝炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(XS VRL)購(gòu)自蘇州西山生物技術(shù)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-01)膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.1.3主要儀器與設(shè)備: 水平電泳儀(Tanon)、微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Nanodrop 2000)、凝膠成像處理系統(tǒng)Gel Image System(Tanon)、普通PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)、實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI One step plus)、生物安全柜(Thermo)、全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信實(shí)驗(yàn)發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物與探針的設(shè)計(jì): 從NCBI的FTP中下載兩株MHV基因組序列，分析比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因28879-29145 Murine hepatitis virus strain JHM，29142-29828 Murine hepatitis virus strain JHM, 29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM有非常好的種內(nèi)特異和種間的差異性。選擇了此3個(gè)基因作為候選基因，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物對(duì)和探針，經(jīng)過(guò)篩選和驗(yàn)證，本研究最終選取29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM作為靶基因。引物、探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成(見表1)。

表1 MHV TaqMan熒光定量PCR引物及探針序列Table 1 MHV TaqMan fluorescent quantitative PCR primers and probe sequences

1.2.2樣品的收集及前處理:連續(xù)無(wú)菌采集小鼠新鮮糞便，充分混勻，分別用液氮研磨法、磁珠勻漿法以及PBS溶解離心法3種前處理方法處理，重復(fù)提取3次。液氮研磨法：取新鮮糞便在液氮環(huán)境下充分研磨，20 mg/份分裝，分裝3份，加入600 μL裂解液，渦旋混勻后，按試劑盒操作步驟提取。磁珠均漿法：取新鮮糞便20 mg/份分裝，分裝3份，分別于磁珠混合后加入600 μL裂解液，使用磁珠勻漿儀55 Hz，10 min充分研磨后，按試劑盒操作步驟提取。PBS溶解離心法：取新鮮糞便20 mg/份分裝，分裝3份，分別溶于140 μL無(wú)菌PBS緩沖液，渦旋混勻后12 000 r/min離心5 min后，取上清液于另一RNase-Free的離心管中，加入600 μL裂解液，充分混勻后，按試劑盒操作步驟提取。

同時(shí)采集血清樣本，用于檢測(cè)抗體情況。另取小鼠糞便，在液氮環(huán)境下充分研磨， 20 mg稱量分裝，用于固體組試劑盒提??；取20 mg糞便溶于140 μL RNase-Free的PBS緩沖液中，充分混勻后，用于液體組試劑盒提取。

1.2.3核酸提取: 根據(jù)6種不同試劑盒所針對(duì)提取樣本的差異，可將試劑盒分為固體樣本提取組和液體樣本提取組，TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL 3個(gè)試劑盒為固體樣本提取組，TIANGEN SD101、QIAGEN 52904、ABI AM1840 3個(gè)試劑盒為液體樣本提取組。按照試劑盒說(shuō)明書，手動(dòng)提取病毒RNA，并進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?，重?fù)提取3次。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR檢測(cè)：用TaqMan試劑盒對(duì)不同方法提取的病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，探針(5 μmol/L)1 μL，模板cDNA 2.0 μL，補(bǔ)水至 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?50 ℃培育 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性 15 s，60 ℃退火延伸 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)并讀取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 樣本前處理方法比較

分別用磁珠勻漿法、液氮研磨法以及PBS溶解離心法，對(duì)3份MHV陽(yáng)性小鼠的糞便進(jìn)行處理，使用TIANGEN DP422核酸提取試劑盒提取病毒RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，液氮研磨法對(duì)病毒RNA提取效率顯著高于另外兩種，見表2。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，針對(duì)小鼠肝炎病毒，液氮研磨法提取效率也是最高的，見表3。

表2 3種樣本前處理方法比較的結(jié)果Table 2 Results of comparison of three sample pretreatment methods

注：**表示差異極顯著，P<0.01

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01

表3 TaqMan熒光定量PCR對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison results of TaqMan fluorescence quantitative PCR

注：**表示差異極顯著，P<0.01，Undetermined表示未檢出

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01，Undetermined means not detected

2.2 6種試劑盒提取MHV核酸效率的比較

利用6種試劑盒，分別提取MHV陽(yáng)性小鼠的糞便樣本，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在提取效率上，TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL、QIAGEN 52094、TIANGEN SD101均具有較高的提取效率，其中 TIANGEN DP422核酸提取效率最高，且顯著高于其他各試劑盒(見表4)。熒光定量TaqMan-PCR 檢測(cè)，TIANGEN DP422、XS VRL、QIAGEN 52094、TIANGEN SD101以及ABI AM1836 5種試劑盒均能得到特異性的擴(kuò)增條帶和曲線(見圖1)，MO BIO 26000試劑盒未檢出MHV，TIANGEN DP422和XS VRL試劑盒的Ct值較低，針對(duì)小鼠肝炎病毒提取效果較好，其余3種試劑盒無(wú)顯著差異。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI的FTP中下載2株MHV基因組序列比對(duì)一致。同步開展的重復(fù)性試驗(yàn)表明，QIAGEN 52904試劑盒(變異系數(shù)：0.02991)重復(fù)性最好，TIANGEN DP422試劑盒(變異系數(shù)：0.03212)次之，詳見表5。

表4 6種試劑盒對(duì)糞便中病毒RNA提取效率比較結(jié)果Table 4 Comparison of the efficiency of viral RNA extraction from feces in six kits

注：**表示差異極顯著，P<0.01

Note:**indicates that the difference is extremely significant，P<0.01

表5 6種試劑盒TaqMan-qPCR檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of six kits TaqMan-qPCR detection

圖1 六種試劑盒檢測(cè)的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves detected by six kits

3 討論

針對(duì)小鼠肝炎病毒目前診斷的方法有病毒分離與鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)、組織病理學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)即為其中一種。本實(shí)驗(yàn)從糞便中提取小鼠肝炎病毒RNA檢測(cè)，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則的同時(shí)，盡可能減少病原檢測(cè)對(duì)本動(dòng)物的應(yīng)激刺激或犧牲。但糞便樣本復(fù)雜，病毒RNA極易被降解，很大程度上影響了MHV核酸的提取效率，因此糞便樣本的前處理尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選用液氮研磨法、磁珠勻漿法和PBS溶解離心法進(jìn)行比較，液氮研磨法需手動(dòng)研磨且需近距離的接觸液氮，耗時(shí)費(fèi)力，具有一定的危險(xiǎn)性；磁珠勻漿法使用磁珠勻漿儀自動(dòng)勻漿處理，操作較為簡(jiǎn)便；PBS溶解離心法操作最簡(jiǎn)便?？紤]到提取效率的優(yōu)勢(shì)，選用液氮研磨法。與李冬民等[6]、戴方偉等[7]描述基本一致，可用于熒光定量PCR檢測(cè)研究中。但針對(duì)大量樣本的檢測(cè)，建議可使用磁珠勻漿法提取。劉香梅等[8]在自然感染小鼠肝炎病毒的早期檢測(cè)過(guò)程中，也從小鼠糞便中檢測(cè)到MHV，提示PCR法在早期診斷中的優(yōu)勢(shì)。

據(jù)相關(guān)研究表明, 不同試劑盒的病毒核酸提取效率具有一定差異[9-11]。因此，選擇提取效率高、價(jià)格低、操作方便的試劑盒，以便快速有效地進(jìn)行病原檢測(cè)十分重要。本研究選用了市售的6種核酸試劑盒進(jìn)行比較，6種試劑盒均為手動(dòng)提取，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，耗時(shí)按單個(gè)樣本提取計(jì)。在提取效率上，固體樣本組3種方法(TIANGEN DP422、MO BIO 26000、XS VRL)均具有較高的提取效率，TIANGEN DP422提取效率最高，且與其他幾個(gè)試劑盒具有顯著差異。在重復(fù)性方面，6種試劑盒均較好。從各試劑盒的提取方法、價(jià)格、提取時(shí)間、提取樣本量以及所需自備試劑和輔助設(shè)備等因素綜合分析，ABI AM1836為磁珠法提取，需要輔助磁力架提取，提取樣本量受限于所選磁力架的規(guī)格，本實(shí)驗(yàn)室選用磁力架可同時(shí)提取8個(gè)樣本，提取的樣本量較小，不適宜大量樣本提取。其余五種均為膜吸附法提取，其中MO BIO 26000試劑盒使用時(shí)，需額外附加渦旋儀適配器，以輔助提取過(guò)程，單次可提取樣本量最大，但操作步驟比較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，價(jià)格較貴(100元/份樣本)，且針對(duì)小鼠肝炎病毒未能檢出。QIAGEN 52094和TIANGEN SD101主要針對(duì)液體樣本，針對(duì)固體糞便樣本操作則較TIANGEN DP422和XS VRL繁瑣，且相比提取效率也具有顯著差異，可能提取小鼠尿液更具優(yōu)勢(shì)。TIANGEN DP422試劑盒價(jià)格較便宜(28元/份樣本)。

綜合以上因素分析認(rèn)為，糞便樣本的前處理，液氮研磨法較好；糞便中小鼠肝炎病毒RNA的提取，TIANGEN DP422效率最高，價(jià)格較便宜，推薦用于小鼠肝炎病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)。