黃蘭林，梅馨月，李 詳，李 想，祖艷群，何永美，李 元

（云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201）

稻瘟病是我國影響水稻生產(chǎn)最嚴重的病害之一，是由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻真菌性病害，是制約水稻生產(chǎn)的重要因子，導致水稻減產(chǎn)或品質(zhì)嚴重下降[1]。適當劑量的UV-B（波長280～315 nm的紫外光）能有效減少病害，與此同時還能增加水稻苯丙氨酸解氨酶活性和類黃酮含量，在2.5 kJ·m-2和5 kJ·m-2UV-B輻射條件下會顯著增加，這將有效抵御UV-B脅迫，減輕UV-B對水稻帶來的傷害[2]。雖然在高強度UV-B輻射如4.0 kJ·m-2和8.0 kJ·m-2時，根據(jù)水稻品種、溫度和降雨頻率不同等原因，會對水稻生長和產(chǎn)量有不同的影響，但其影響程度遠低于稻瘟病害[3]。

紫外線對真菌有很多影響，如死亡、抑制孢子萌發(fā)，生長延遲和突變[4]。UV-B對稻瘟病菌的生長、產(chǎn)孢[5]和稻瘟病菌侵染生長[6]有著延緩的作用，并根據(jù)輻射劑量不同而影響程度不同。UV-B對植物病原菌疾病、分生孢子及其萌發(fā)物，毒力都存在影響，如小麥條銹病[7]、番茄花葉病[8]、十字花科黑腐病[9]、玉米大斑病，這取決于UV-B處理時間、品種、接種水平和植物年齡，一定劑量的UV-B使分生孢子產(chǎn)孢時間滯后，致病力下降[10]。同時也發(fā)現(xiàn)隨著UV-B輻射的增強，球孢白僵菌[11]、絲孢菌綠僵菌[12]、蝗綠僵菌萌發(fā)時間滯后，毒力降低[13]。

紫外線作為誘變劑主要針對生物大分子DNA[14]，使其發(fā)生誘變，造成基因突變，這必然會影響基因轉錄和蛋白質(zhì)的合成，這或許也會影響病菌的致病力[15]。例如木黴菌和米曲霉黑色素合成基因在低劑量UV-B輻射下表達水平的增加，減少了UV-B輻射帶來傷害的同時提高了致病力[16]，而十字花科黑腐病菌，在受射線如紫外光、X光照射后，Lon基因突變，細胞會因抑制細胞分裂蛋白累積，無法形成隔壁[17]而無法致病，玉米大斑病菌黑色素合成基因Stscd經(jīng)UV-B照射45 min后表達量明顯上升，1 h時表達量達到最高峰，之后開始下降[18]。這些由UV-B引起的基因表達改變，通過改變各種表型來影響侵染致病力[19]。研究發(fā)現(xiàn)，NUV（近紫外光）對病原菌的基因表達也會有重要的影響，水稻褐斑病NUV照射可以抑制產(chǎn)生孢子并使PHR1表達增強[20]。除致病基因外，響應NUV的光解酶基因表達水平被NUV輻射會特異性增強，這些反應由藍/UVA吸收光感受器介導[21]，在米曲霉[22]和粗糙脈孢菌[23]中，也發(fā)現(xiàn)了相似的真菌藍光調(diào)節(jié)蛋白，由此來應對UV輻射[24]。

目前，國內(nèi)外對于水稻稻瘟病菌致病基因已有大量報道，光脅迫如紫外和近紫外輻射對各類植物和昆蟲病原菌致病基因的影響研究也屢見不鮮。但對于UV-B處理稻瘟病菌，對致病基因表達影響的報道尚少。在我國云南元陽梯田地區(qū)，高海拔下增強的紫外輻射條件下，稻瘟病病情指數(shù)遠低于其他地區(qū)，其中在5 kJ·m-2強度下病情指數(shù)降到最低[6]。在稻瘟病菌侵染整個過程中，從芽管伸長到入侵宿主都涉及細胞壁的合成和變化，已知幾丁質(zhì)為真菌細胞壁的主要組分，幾丁質(zhì)酶是其中重要的胞壁修飾酶[25]，Chitinase參與合成幾丁質(zhì)酶，同時也與菌絲生長及孢子的萌發(fā)密切相關[26]，參與稻瘟病菌生長發(fā)育及形態(tài)建成以至侵染致病過程[27]。在稻瘟病菌穿透寄主表皮之前，MPG1基因能感知水稻表皮的疏水信號，這是稻瘟病菌能形成附著胞的必要條件之一[28]；感知疏水信號后，MAGB基因誘導產(chǎn)生附著胞[29]，形成附著胞后所需的侵入機械壓力受cAMP途徑調(diào)節(jié)，而此信號途徑依賴由CPKA基因編碼的蛋白激酶A的活性[30]。為了探尋其中增強的UV-B輻射能有效減少稻瘟病害的分子機理，本研究通過UV-B處理稻瘟病菌，利用實時熒光定量PCR對4個稻瘟病菌致病相關基因（Chitinase、MGP1、MAGB、CPKA）進行表達分析，以期通過分析其表達水平來解釋UV-B能如何影響稻瘟病菌的致病力，為在分子層面探索UV-B影響稻瘟病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與使用儀器

1.1.1 供試材料

本試驗供試菌株為田間稻瘟病發(fā)病水稻上分離保存所得的YN737。

水稻品種：白腳老粳。

1.1.2 試劑

購自 Invitrogen 的 Trizol Reagent、購自 Roche的Universal cDNA Master反轉錄試劑盒和Essential DNA Green Master，購自Sigma公司的曲利苯蘭。

1.1.3 儀器

本試驗采用的儀器：Eppendorf Centrifuge 5424 R、Thermo Nanodrop 2000、BIO-RAD Molecular Imag?er、Roche LightCycler 96 Instrument和 OLYMPUS BH-2顯微鏡等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株及水稻的培養(yǎng)

將水稻稻瘟病菌株YN737在米糠培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)7 d，用8 mm打孔器切取菌餅放置在鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基上，28℃與22℃的光暗循環(huán)交替培養(yǎng)5 d至菌絲長滿覆蓋玻璃紙進行UV-B輻射處理。

挑選飽滿健康的白腳老粳水稻種子進行催芽，待種子露白，將水稻播種于10 cm×20 cm×7 cm的方盆中，置于溫室中培養(yǎng)。

1.2.2 UV-B輻射處理

將培養(yǎng)皿皿蓋打開放置在0.5 h預熱穩(wěn)定后的紫外燈（波長280～320 nm，北京電光源研究所提供）正下方，通過調(diào)整紫外燈與培養(yǎng)皿的垂直距離來調(diào)整輻射強度，其中燈管用0.13 mm醋酸纖維素膜包被，以去除小于290 nm的短波輻射，用UV-B輻射測定儀（北京師范大學光電儀器廠）測定植株頂端輻射強度。輻射強度為0、2.5 kJ·m-2和5 kJ·m-2，輻射處理時間為10、60、120 min，以及輻射120 min后黑布包被避光放置6、24 h，未做輻射處理即輻射處理時間0 min為CK。

待水稻長至三葉一心期，剪取葉片分別制成長3 cm的葉段，采用滴液法將孢子懸浮液接種于水稻葉段上（黑暗保濕24 h），每片葉滴3滴孢子懸浮液，每滴5μL，接種后2、8、32 h、3 d采樣染色，接種同時對水稻進行UV-B輻射處理，強度為0、2.5 kJ·m-2和5 kJ·m-2。

1.2.3 材料收集與染色

UV-B輻射處理后，一部分用滅菌的玻片將玻璃紙上的菌絲刮下放入盛有液氮的研缽迅速冷凍研磨；另一部分用無菌水小心洗下孢子，滅菌紗布濾掉菌絲，將孢子濃度調(diào)至1×106個·mL-1，將孢子懸浮液均勻噴灑在疏水表面，26℃黑暗保濕培養(yǎng)2、8 h后液氮速凍刮取表面培養(yǎng)物進行研磨。

接種觀察試驗為每一處理設置3次重復，每一重復為10個葉段，對葉段采用曲利苯蘭-酒精乳酚油染色觀察。在曲利苯蘭-酒精乳酚油（無水乙醇20 mL，苯酚10 mL，83%乳酸10 mL，水10 mL，曲利苯蘭10 mg）中沸水浴10 min；將染色后的葉段置于水合飽和氯醛溶液中脫色過夜；保存于50%甘油中。在OLYMPUS BH-2顯微鏡下觀察葉段，接種后2、8 h和3 d照相記錄稻瘟病菌萌發(fā)形成芽管、附著胞、侵染菌絲侵入水稻細胞的過程。

1.2.4 RNA的提取

取50～100 mg樣品，加入1 mL Trizo（l樣本的量不宜超過Trizol體積的10%）充分搖勻后室溫靜置15 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min；小心吸取上清液至新的無酶管，加入200μL氯仿?lián)u勻，室溫靜置5 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min；吸取上清液，加入異丙醇200 μL，室溫靜置2～5 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min；去上清，加入1 mL 70%乙醇，4℃13 000 r·min-1離心 5 min；去上清，小心吸取殘余液體，室溫靜置2～10 min；加50～200 μL無核酸酶水，于-80℃保存。

1.2.5 RNA質(zhì)量和濃度的檢測

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用Thermo Nanodrop 2000對RNA進行濃度檢測和純度檢測。

1.2.6 cDNA模板的合成

用Universal cDNA Master反轉錄試劑盒對樣品進行反轉錄，Reaction Buffer（5×conc）4 μL，Enzyme Mix（10×conc）2μL，根據(jù)RNA濃度調(diào)整模板RNA和水的用量，反轉體系終體積為20μL，42、85、65℃分別水浴15、5、15 min，完成反轉錄。

1.2.7 引物設計

利用Primer Premier和NCBI/Primer-BLAST，分別設計了看家基因Actin和其他目的基因的引物（表1），由擎科昆明公司合成提供。

1.2.8 實時熒光定量PCR

以Actin為內(nèi)參，按照20μL體系（水3μL、10×conc PCR Primer 2 μL、Master Mix10 μL、DNA Tem?late 5μL）進行qRT-PCR擴增，反應程序分別為95℃預變性600 s，三步95℃～60℃～72℃擴增，45個循環(huán)，95℃～65℃～97℃退火溶解。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010和LC 96進行整理作圖，差異顯著性檢驗采用SPSS 22.0 Duncan檢驗法（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 RNA的質(zhì)量與濃度的檢測

經(jīng)過1.2%凝膠瓊脂糖電泳，結果如圖1所示，RNA18 S、28 S條帶清晰，5 S模糊，說明RNA完整性良好。260、280 nm下測定RNA的吸光度，其中A260/A280值均在1.82～2.04之間，說明RNA有機污染少，降解少，質(zhì)量較好，滿足后續(xù)實驗要求。4個目的基因與內(nèi)參基因Actin的溶解曲線平滑，單一峰，無引物二聚體，溫度介于85～88℃之間，說明引物具有特異性，擴增結果可靠。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 凝膠瓊脂糖電泳圖Figure 1 Gel agarose electrophoresis

2.2 比較C（tΔΔCt）法分析各目的基因的相對表達變化

從圖2 Chitinase的表達變化來看，在2.5 kJ·m-2輻射強度下，Chitinase只在輻射時間為60 min處理下與對照相比表達有顯著升高，上調(diào)了93%，其余時間均沒有顯著變化，而在5 kJ·m-2輻射強度下，隨著輻射時間的延長，Chitinase表達逐漸降低，在120 min處理下，相對表達量降到最低，從輻射10 min開始到輻射120 min結束，表達較對照分別下調(diào)了64%、22%和94%，而在放置6、24 h后，其表達量逐漸回升為對照的48%和54%。

圖2 不同UV-B處理Chitinase的表達變化Figure 2 Changes of Chitinase expression under different UV-B treatments

圖3 不同UV-B處理MGP1的表達變化Figure 3 Changes of MGP1 expression under different UV-B treatments

對于MGP1，兩個輻射強度下（圖3），各個處理時間對MGP1表達的影響不大，2.5 kJ·m-2輻射處理時，表達量在各處理時間并沒有顯著變化，僅在5 kJ·m-2輻射處理時，隨著輻射時間的增加，表達量緩慢下調(diào)，到120 min處理時，表達量較對照下調(diào)了19%，并且在輻射結束后放置6 h和24 h，表達恢復至正常水平。

而MAGB（圖4）則是在5 kJ·m-2輻射強度下，各處理時間沒有顯著變化，在2.5 kJ·m-2強度下，表達會在輻射10～120 min受到顯著抑制，與對照相比分別下調(diào)了57%、17%和40%，去除輻射放置6 h后，MAGB的表達會回升為對照水平，放置24 h，表達回升且較對照上調(diào)了14%。

在兩個輻射強度下，CPKA呈相似的表達趨勢（圖5），在5 kJ·m-2處理時的表達整體低于2.5 kJ·m-2。短時間的輻射使CPKA的表達上升，與對照相比，2.5 kJ·m-2輻射時，10 min與60 min的輻射處理與撤去輻射后放置6、24 h表達上調(diào)了1～2倍。5 kJ·m-2輻射時，10 min輻射處理時，CPKA的表達與對照相比上調(diào)了49%，輻射60 min和120 min時，表達下調(diào)了82%和61%，在撤去輻射后放置6、24 h，表達恢復至對照水平。以上結果表明，UV-B輻射劑量的增加對MGP1的表達沒有顯著影響，而Chitinase、MAGB、CPKA 3個基因的表達均有所下調(diào)，在去除輻射后，表達回升。

圖4 不同UV-B處理MAGB的表達變化Figure 4 Changes of MAGB expression under different UV-B treatments

圖5 不同UV-B處理CPKA的表達變化Figure 5 Changes of CPKA expression under different UV-B treatments

2.3 UV-B輻射處理下稻瘟病菌侵染階段生長量的變化

芽管、附著胞和菌絲侵入形成菌落的過程中，5 kJ·m-2處理比2.5 kJ·m-2處理能更大程度地抑制病原菌的侵染（圖6）。2.5 kJ·m-2處理下稻瘟病菌各侵染階段的生長量在芽管形成階段沒有顯著差異，在附著胞和菌落形成階段與對照相比下降了31%和28.6%；而在5 kJ·m-2處理下，3個階段都有顯著下降，分別減少了45.1%、82.2%和75.2%。

圖6 UV-B處理下各侵染階段稻瘟病菌生長量Figure 6 Growth of Magnaporthe grisea in different stages of infection under UV-B treatment

3 討論

3.1 UV-B輻射處理下致病基因表達水平變化特征

UV-B輻射處理能使菌絲生長變得致密、緊湊，產(chǎn)孢量也隨著輻射強度的增加而顯著下降[5]，在5 kJ·m-2處理時，Chitinase的表達一致。2.5 kJ·m-2輻射處理，在輻射60 min時，Chitinase的表達顯著升高，可能是由于低輻射強度的UV-B讓病菌對此做出了反應來保護自身，是病菌產(chǎn)生的防護措施[31]，如加快細胞的合成與分解來減輕UV-B帶來的傷害。黑色素廣泛存在于各種真菌體內(nèi)[16]，黑色素基因表達的升高能降低病原菌受到的UV傷害[32]，并且發(fā)現(xiàn)玉米大斑病黑色素基因在紫外輻射后也表現(xiàn)出相同的趨勢，會在輻射處理60 min時，表達量上升至最高峰，隨后下降[18]，與本試驗Chitinase表達趨勢相似，輻射下Chi?tinase與玉米大斑病黑色素基因表達變化的相似，可能是由于激發(fā)了相似的代謝途徑來進行自我保護。

而對于MGP1，不同輻射劑量對其表達不產(chǎn)生顯著影響，僅在高輻射劑量表達才會有少量下調(diào)，推測MGP1對UV-B輻射耐受。細胞已經(jīng)開發(fā)出許多修復或耐受機制來抵消UV或任何其他應激物造成的分子損傷[19]，在光解酶的幫助下光還原是各種生物體中最重要且經(jīng)常發(fā)生的修復機制之一[33]，此外，切除修復可分別借助多種糖基化酶和聚合酶在幾種生物體分子修復中也起重要作用[34]。誘變修復或二聚體旁路、重組修復、細胞周期檢查點，細胞凋亡和某些替代性修復途徑等機制也存在于各種生物體[22]，推測在UV-B處理下可能激發(fā)了其中的修復機制，最終免于MGP1表達的改變，但其中可能存在的路徑尚不明確。

MAGB則受2.5 kJ·m-2輻射強度的UV-B時有較5 kJ·m-2輻射強度更明顯的變化，可能是由于MAGB對低輻射強度較敏感。致病基因的表達除取決于分生孢子的生理狀態(tài)之外，還取決于輻射劑量[12]。CP?KA在兩種輻射強度下有著一致趨勢的表達變化，在5 kJ·m-2輻射強度處理CPKA的表達量整體低于2.5 kJ·m-2處理，隨輻射劑量的增加，基因轉錄受到破壞，其表達受到抑制。CPKA編碼合成致病性所必需的蛋白激酶A的催化亞基單位PKA-c，而cAMP途徑依賴于蛋白激酶A的活性，這也可能導致cAMP途徑受到影響[35]，進一步影響稻瘟病菌的致病力，cAMP信號通路對外界壓力脅迫如熱激、紫外線輻射、電離輻射等都會做出應答[36]。結合本試驗，得知只有高強度輻射處理時能抑制CPKA的表達，撤去輻射，放置6 h和24 h都能發(fā)現(xiàn)CPKA的表達恢復對照水平，從白化酵母菌中也能得出，輻射后的光復活和黑暗處理都能產(chǎn)生光還原[37]。

從Chitinase、MAGB、CPKA的表達變化不難發(fā)現(xiàn)，在去除UV-B輻射后，降低的表達量會有所回升，所以推測通過逆境篩選留存的稻瘟菌株有適應而產(chǎn)生的修復功能——光還原[37]，所以持續(xù)或者更長時間的UV-B照射才能使稻瘟病菌降低或喪失致病力。從本文的試驗結果可以看到，Chitinase、MAGB、CPKA在UV-B輻射處理下，表達都有顯著變化，大致趨勢都是在5 kJ·m-2處理強度時表達量相對于對照降低了，變化程度有所不同，已有的研究中就發(fā)現(xiàn)光響應基因中2.8%的基因是光敏感的，2%誘導和0.8%抑制[38]。

3.2 UV-B輻射下致病基因表達水平變化與稻瘟病菌侵染力的關系

試驗結果印證了UV-B輻射能減輕稻瘟病害以及影響其致病力的假說，其中Chitinase在稻瘟病菌各生長期都有重要作用，說明UV-B對其影響可能貫穿整個生育階段，低強度輻射時，其表達上升來減輕紫外輻射帶來的傷害，隨著輻射強度增強和時間的延長，表達下降以致稻瘟病整個生育階段都有可能受到傷害和抑制，例如產(chǎn)孢量的減少、芽管、附著胞、侵染菌絲形成受阻等等；MAGB與CPKA的表達都影響著cAMP途徑[35]，該途徑與稻瘟病菌的生長發(fā)育、孢子萌發(fā)、侵染結構形成與致病性都具有重要作用[39-41]。MAGB和CPKA基因的表達變化表示，適當?shù)淖贤廨椛淠茏尭街纬墒茏枰约扒秩緳C械壓力的不足或喪失。從試驗結果可以得出，這4個基因在UV-B輻射處理下，其表達都有顯著改變，其中5 kJ·m-2處理時，更加顯著抑制了表達水平，這與試驗結果5 kJ·m-2的UV-B輻射能更大程度減少芽管、附著胞和菌絲侵染，從而更大程度地減少稻瘟病害相一致。

雖然近年對稻瘟病菌致病力相關基因[42]和UV-B輻射對動植物真菌病害影響的研究已較為豐富，但是在分子水平驗證UV-B輻射對稻瘟病菌影響的研究尚少，機理尚不清晰，UV-B調(diào)節(jié)基因的功能尚不清楚，還需進一步探索生物學細節(jié)來驗證。如調(diào)查過度表達，基因破壞或引入反義RNA等實驗[23]等，將有助于揭示稻瘟病菌在UV-B作用下分子層面的機理。

4 結論

（1）UV-B輻射能有效減輕水稻稻瘟病的病情指數(shù)，減少病害，控制好輻射劑量（如5 kJ·m-2輻射處理）能使病害程度顯著降低。

（2）UV-B輻射能有效降低水稻稻瘟病病害的重要機理是UV-B輻射能使稻瘟病菌致病基因的表達發(fā)生變化，尤其在5 kJ·m-2輻射處理120 min時，能顯著減少致病基因的表達，從而降低病菌入侵對應各個發(fā)育階段的生長量來減少病害。