韓 娜，陶宗婭，代文秀，黃 攀，劉 巧，賴金龍，吳 國，盧 紅

（四川師范大學生命科學學院，成都 610101）

銫（Cesium，Cs）為第一主族稀有堿金屬元素，其穩(wěn)定同位素133Cs是制造光電管、光電池的良好材料，也被廣泛用于電子器件、催化劑、特種玻璃、生物化學、醫(yī)藥材料及空天領域等。隨著核工業(yè)發(fā)展及核事故偶發(fā)，放射性核素不可避免地進入環(huán)境，其中137Cs半衰期長、裂變量大，被認為是最危險的放射性核素之一[1]，當134Cs、137Cs等放射性核素通過環(huán)境進入食物鏈后，極易經(jīng)農(nóng)畜禽產(chǎn)品及其制品進入人體，因其內(nèi)輻射或取代鉀（K）而影響人體健康。

土壤是種植業(yè)不可或缺的自然資源，可用于治理土壤放射性核素污染的方法有物理法、化學法和生物修復法。物理或化學方法如土壤清洗、鏟土法、離子交換法、可剝離性膜法等，存在成本高、易破壞土壤結構、土壤理化性質惡化、易造成二次污染等缺點。生物修復（植物修復、微生物修復、植物-微生物聯(lián)合修復）具有經(jīng)濟、環(huán)保、可有效處理表層及亞表層甚至更深層污染土壤等優(yōu)點[2]，受到廣泛關注。植物修復技術具有周期長、修復效率低等局限性[3]，微生物修復難以修復大面積的污染，而植物-微生物聯(lián)合修復綜合了前二者的優(yōu)勢，克服單一修復技術的局限性，能夠強化植物對核素的固定、積累、轉化作用，明顯提高土壤核素污染的修復效率，更大程度地減弱核素污染的生物學效應[4]。

淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）是土壤及多種植物根系的習居菌，也是植物寄生線蟲的重要天敵，是一種被廣泛應用的生防菌和功能菌[5]，但利用其與植物互作進行土壤或水體中核素污染修復的研究還鮮見報道。印度芥菜（Brassica juncea L.）是植物修復研究中公認的模式植物，對 Cd[6]、Pb[7]、Cs[8]、Sr[9]等多種污染金屬具有較強的耐受性和富集能力。

目前，關于聯(lián)合修復過程中植物-微生物的互作機制尚不夠明確。本文以一株Cs+富集真菌淡紫擬青霉A10及其發(fā)酵液為試材，測試分析A10的溶磷、解鉀、產(chǎn)植物生長素（IAA）類似物及A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗蓄積Cs+的影響，研究A10的植物促生特性及其在印度芥菜幼苗蓄積Cs+的過程中可能的作用機制，以期為A10-印度芥菜互作體系修復土壤Cs+污染提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 高效富集菌的篩選及鑒定

供試菌株是本研究室從Cs+污染的盆栽印度芥菜根際土壤中分離獲得，經(jīng)ITS rDNA基因序列分析鑒定，該菌株與Genebank數(shù)據(jù)庫中6株淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）的18S ribosomal RNA序列的覆蓋度和相似度均為100%，同時結合形態(tài)學鑒定結果，確定該菌株為淡紫擬青霉，并命名為淡紫擬青霉A10（Genebank登錄號為MH542655）。

1.1.2 溶磷、解鉀固體培養(yǎng)基制備

用于溶磷研究的無機磷培養(yǎng)基：Ca（3PO4）210.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·8H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1.0 L。

用于解鉀研究的硅酸鹽培養(yǎng)基：蔗糖5.0 g，Na2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl3·7H2O 0.005 g，土壤礦物0.1 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1.0 L。其中土壤礦物準備方法為：取適量土壤，先去除大塊的殘渣，再加6 mol·L-1HC（l土壤與鹽酸之比為1∶10），煮沸30 min，過濾，用蒸餾水淋洗數(shù)次，烘干備用。

參照林先貴[10]的方法配制好上述培養(yǎng)基溶液后，調(diào)節(jié)pH值為7.0，再配制Cs+終濃度 [ρ（Cs+）]為0、25、50、100 mg·L-1的處理培養(yǎng)基溶液；加入瓊脂，加熱熔化，滅菌，冷卻至室溫后倒平板，備用。

為方便觀察A10的菌落形態(tài)，用接種針沾取少量純化的A10菌絲體點植于培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)一定時間后觀察菌落形態(tài)，用掃描儀（BenQ Scanner 5560）保存掃描圖片，用Image J測量菌落直徑。

1.1.3 溶磷、解鉀液體培養(yǎng)基制備及搖瓶培養(yǎng)

用于溶磷研究的搖瓶采用不加瓊脂的無機磷培養(yǎng)基，用于解鉀研究的搖瓶采用不加瓊脂的硅酸鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)液滅菌后，配制 Cs+終濃度[ρ（Cs+）]為 0、25、50、100 mg·L-1的處理液；用打孔器挑取活化的A10菌餅（直徑4 mm）置于搖瓶中，以不接菌的為對照，各處理均重復3次。置恒溫搖床（150 r·min-1、28℃）振蕩培養(yǎng)15 d后，制備上清液（即A10發(fā)酵液），用于測定速效磷含量和有效鉀含量。

1.1.4 A10產(chǎn)IAA類似物培養(yǎng)

參照林先貴[10]、沈萍等[11]的方法，以不加孟加拉紅溶液作為改良馬丁液體培養(yǎng)基（MM）。實驗處理分3組：接種A10于MM中（記為A10）；接種A10于ρ（Cs+）100 mg·L-1的MM中（記為A10+Cs100）；接種A10于ρ（Cs+）100 mg·L-1和色氨酸500 mg·L-1的MM中（記為A10+Cs100+Trp500），以不接種的MM為對照（記為CK）。各處理振蕩培養(yǎng)（150 r·min-1、28℃）15 d后，制備上清液（即A10發(fā)酵液），用于測定IAA類似物。

1.1.5 A10發(fā)酵液制備

將A10接種于新鮮的MM中，振蕩培養(yǎng)（150 r·min-1、28 ℃）8 d，過濾，濾液離心（10 000 r·min-1、4℃、10 min）2次，上清液即為A10發(fā)酵液，用去離子無菌水調(diào)節(jié)同一批次或不同批次的發(fā)酵液，使其有效活菌數(shù)（血球計數(shù)板測定孢子數(shù)，重復3次，求平均值）為107cfu·mL-1，備用。

1.1.6 供試植物及其培養(yǎng)

上述A10發(fā)酵液用1/2 Hoagland營養(yǎng)液（參照湯紹虎等[12]的方法自配）稀釋不同倍數(shù)：5、35、55倍（設計依據(jù)來自以根長為指標的預備實驗，可確保印度芥菜幼苗能夠生長，分別記作5x、35x、55x）。取適量上述稀釋液配制成ρ（Cs+）為0、25、100 mg·L-1的處理液，以1/2 Hoagland營養(yǎng)液作為對照（CK）；將上述處理液和對照分裝到組培瓶（容量200 mL、口徑55 mm、直徑64 mm、高90 mm）中，每瓶190 mL。

印度芥菜（Brassica juncea L.）種子購自湖北武漢安谷農(nóng)業(yè)科技有限公司，先用75%的酒精消毒5 min，再用無菌水沖洗數(shù)次，播種于以紗布兜底的紙杯中（每杯50粒），將紙杯置于組培瓶上，以兜底的紗布剛好接觸到液面不浸泡種子為準。每日上午同一時間補充一定量1/2 Hoagland營養(yǎng)液，光照培養(yǎng)（25℃，光強 3500 lx，光/暗比為12 h/12 h），每處理重復5次，7 d后取出印度芥菜幼苗依次用20 mmol·L-1的EDTA-Na2、去離子水沖洗后，分為地上部和地下部，編號，烘干至恒質量，用于測定幼苗Cs+蓄積量和K+含量。

1.2 測定方法

1.2.1 A10在溶磷、解鉀固體培養(yǎng)基上的生長動態(tài)

培養(yǎng)期間，觀察、記錄菌落形態(tài)，測量菌落直徑，參見1.1.2。

1.2.2 A10發(fā)酵液中速效磷、有效鉀含量

1.1.3 中的發(fā)酵液離心，吸取無機磷液體培養(yǎng)基上清液2 mL，定容至50 mL，采用鉬銻抗比色法測定速效磷含量；采用相同的方法，吸取硅酸鹽液體培養(yǎng)基上清液2 mL，定容至50 mL，用火焰原子分光光度計測定有效鉀含量；3次獨立重復。

1.2.3 A10產(chǎn)IAA類似物

1.1.4 發(fā)酵液離心2次，上清液采用Salkowski比色法[13]測定IAA類似物，3次獨立重復。

1.2.4 印度芥菜幼苗Cs+蓄積量和K+含量

稱取適量幼苗地上和地下部分干樣粉末，采用濕法消解法（消解液中HNO3∶HClO4=3∶1）消解至澄清后，定容至50 mL，用原子吸收分光光度計（TAS-990，北京普析）測定Cs+和K+含量（C：mg·L-1），計算Cs+蓄積量和K+含量（A，mg·g-1DW）：

A=C×V/1000m

式中：V為消解液定容體積，50 mL；m為被消解樣品質量，g。均為3次獨立重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan法多重比較，Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 A10的促生特性

2.1.1 溶磷、解鉀能力

將A10接種于不含Cs+的無機磷培養(yǎng)基（圖1A）、硅酸鹽培養(yǎng)基（圖1B）上，培養(yǎng)7 d和15 d時，正常情況下，A10菌落呈圓形，外圈為白色，中間部分為粉色，菌落隆起，表明無滲出液，質地呈絨狀，無可溶性色素。圖1A中A10生長初期菌落呈白色，生長后期菌落呈淡粉色，表明A10能夠正常生長，菌落形態(tài)未發(fā)生改變，圖1B中也呈現(xiàn)出該趨勢，表明A10具有溶磷、解鉀的能力。

將A10接種于ρ（Cs+）0～100 mg·L-1的溶磷、解鉀固體培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)8 d和6 d（圖2），相同濃度Cs+處理下，隨培養(yǎng)時間延長，菌落直徑呈增加的趨勢；相同培養(yǎng)時間時，隨Cs+處理濃度增加菌落直徑呈“先增后降”的趨勢，表明A10對Cs+的耐受性強。

圖1 A10在溶磷培養(yǎng)基（A）和解鉀培養(yǎng)基（B）上的菌落形態(tài)Figure 1 The mycelial morphology of A10 in soluble phosphorus medium（A）and potassium medium（B）

將A10接種于ρ（Cs+）0～100 mg·L-1的溶磷、解鉀液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)15 d后（圖3），A10發(fā)酵液中速效磷含量為 11.99～44.03 mg·L-1，有效鉀含量為21.02～25.75 mg·L-1；較高濃度Cs+（50～100 mg·L-1）處理時A10溶磷能力被顯著抑制（P＜0.05），但一定程度上激活了A10的解鉀潛能。

圖2 含不同濃度Cs+的溶磷、解鉀培養(yǎng)基上A10菌落直徑的變化Figure 2 Changes of colony diameter of A10 in phosphorus medium and potassium medium with different Cs+concentrations

圖3 含不同濃度Cs+的溶磷、解鉀發(fā)酵液中速效磷、有效鉀含量的變化Figure 3 The changes of the contents of soluble phosphorus in the soluble phosphorus medium and the effective potassium in potassium medium with different Cs+concentrations

2.1.2 產(chǎn)IAA類似物

Salkowski顯色結果如圖4A所示。與CK（不接種的MM）比較，實驗組顯示深淺不一的紅色。隨著Cs+濃度增加（圖4B），發(fā)酵液中IAA類似物含量顯著提高（P＜0.05），ρ（Cs+）100 mg·L-1時IAA類似物含量高達4.04 mg·L-1，為CK的22.57倍。結果表明，A10可分泌IAA類似物，外源Cs+處理和色氨酸誘導均可顯著促進A10分泌IAA類似物。

2.2 含Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗生長及蓄積Cs+的影響

2.2.1 根長和幼苗干質量

圖5可見，隨著Cs+濃度增加，CK（營養(yǎng)液處理）和實驗組幼苗根的生長均顯著被抑制（P＜0.05），表明幼根生長點對外源Cs+具有較強的敏感性。與CK相比，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加，根長呈“先降后增”的變化趨勢，稀釋5x處理的根長最短，稀釋35x處理的根長最長（P=0.026＜0.05），表明高濃度發(fā)酵液（5x）抑制幼根生長（P＜0.05），稀釋35x時對根長的促生作用顯著（P＜0.05）。

CK溶液中隨著Cs+濃度增加，幼苗地上、地下部分干質量遞降，不同濃度Cs+與不同稀釋倍數(shù)A10發(fā)酵液共同處理時對幼苗干質量的顯著降低產(chǎn)生疊加效應（圖6）。

2.2.2 A10發(fā)酵液對Cs+蓄積和K+吸收的影響

圖4 A10發(fā)酵液中IAA類似物的定性與定量測試Figure 4 Qualitative and quantitative tests of IAA analogues in A10 fermentation broth

圖5 含不同濃度Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗根生長的影響Figure 5 Effects of the A10 fermentation broth with different Cs+concentration on root growth of Brassica juncea L.seedlings

圖6 含不同濃度Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗地上部和地下部干質量的影響Figure 6 Effects of the A10 fermentation broth with different Cs+concentrationon dry weights of aboveground and underground parts in Brassica juncea L.seedlings

圖7 含不同濃度Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗地上部和地下部Cs+蓄積量的影響Figure 7 Effects of the A10 fermentation broth with different Cs+concentration on Cs+accumulation amount of aboveground and underground parts in Brassica juncea L.seedlings

由圖7可見，隨Cs+濃度增加，CK及各處理幼苗的Cs+蓄積量顯著升高（P＜0.05）；地下部分＞地上部分。當ρ（Cs+）25 mg·L-1時，35x處理幼苗地下部分Cs+蓄積量（3.82 mg·g-1DW）顯著高于5x處理（1.69 mg·g-1DW）。當ρ（Cs+）100 mg·L-1時，35x處理幼苗地上部分Cs+蓄積量高達8.86 mg·g-1DW，為CK（7.44 mg·g-1DW）的1.19倍；地下部分Cs+蓄積量高達16.76 mg·g-1DW，為CK（13.64 mg·g-1DW）的1.23倍，為5x處理（5.77 mg·g-1DW）的2.90倍。結果表明，A10發(fā)酵液稀釋35x時有利于印度芥菜幼苗對培養(yǎng)液中Cs+的蓄積，進入幼苗體內(nèi)的Cs+主要存在于根部。

圖8可見，幼苗K+含量地上部分＞地下部分，但均隨Cs+濃度增加而顯著降低（P＜0.05），不含Cs+的A10發(fā)酵液稀釋55x處理有利于K+的吸收和轉運。

對發(fā)酵液稀釋5x和35x處理幼苗的地上部分Cs+蓄積量與K+含量進行相關性分析（圖9），可見其呈顯著的負相關性（P＜0.05），表明幼苗對Cs+、K+的吸收存在一定的競爭關系，Cs+主要蓄積在根部，K+則大量轉移至地上部分。

3 討論

土壤微生物主要通過吸附、轉化等方式降低放射性核素對微生物自身和植物的毒性。微生物表面存在種類多樣的吸附位點和基團，可在溶液中與金屬離子通過離子交換、絡合、共價吸附等相互作用，將金屬離子吸附在微生物體表[14]。真菌對放射性核素的吸附和吸收機理相對復雜。真菌細胞壁上存在的羥基、羧基和巰基等活性基團或胞外聚合物可通過表面絡合作用、螯合作用與重金屬離子結合形成絡合物或螯合物，將金屬離子固定在細胞壁，因此細胞壁是真菌吸附金屬離子的主要部位[4]，也是緩解金屬毒害的天然屏障。真菌也可通過還原反應將重金屬離子由高價還原為低價[15]，或利用其分泌的有機酸絡合并溶解金屬離子，從而改變金屬的賦存形態(tài)及其生物有效性[14]。

圖8 含不同濃度Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗地上部和地下部K+含量的影響Figure 8 Effects of the A10 fermentation broth with different Cs+concentration on K+contents of aboveground and underground parts in Brassica juncea L.seedlings

圖9 含不同濃度Cs+的A10發(fā)酵液對印度芥菜幼苗地上部Cs+蓄積量與K+含量的相關性分析Figure 9 The correlation analysis between Cs+accumulation amount and the absorbed K+contents of aboveground parts in Brassica juncea L.seedlings

一般認為，Cs+對細胞的毒理機制主要在于Cs+可替代K+，導致需K+的關鍵組分失活而干擾代謝。Cs+是一種較弱的路易斯酸，電荷低、半徑小、與配位體相互作用弱。穩(wěn)定同位素133Cs的毒性小，在非生物和生物系統(tǒng)中有較活躍的遷移性，生物材料對Cs+的親和力比非生物材料高。與非生物材料不同，微生物對Cs+等金屬離子的吸收和轉移是活細胞的主動運輸過程，需要消耗代謝能，因此，利用微生物修復技術去除環(huán)境污染中的Cs+通常需要活的微生物細胞，這些微生物多為可純培養(yǎng)微生物[16]，主要有釀酒酵母菌[17]、叢枝菌根[18]、曲霉 F77[19]、耐輻射細菌等[20]。

淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）屬半知菌綱，絲孢菌科，擬青霉屬，是多種植物寄生線蟲的寄生真菌，具有分布廣、功效多、寄主廣泛、易培養(yǎng)等優(yōu)點。李小龍[21]從淡紫擬青霉518固體發(fā)酵物中分離出的脂類化合物白僵菌素，具有細胞毒性、免疫抑制、細胞凋亡等多種生物活性，對革蘭氏陽性細菌、分支桿菌有較好的抑菌活性，是極具潛力的生防菌和功能菌[14]。淡紫擬青霉NH-PL-03對有機磷農(nóng)藥具有顯著的生物降解活性[22]。本研究結果顯示，淡紫擬青霉A10具有較強的溶磷、解鉀能力（圖1、圖2），外源較高濃度Cs+顯著抑制A10的溶磷能力，但一定程度上激活了A10的解鉀潛能（圖3）。A10發(fā)酵液能產(chǎn)生和分泌IAA類似物，對印度芥菜幼苗根生長的影響表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重效應（圖5），這一結果與李小龍[21]、李芳[23]的研究結果一致。人們對淡紫擬青霉胞內(nèi)、胞外可調(diào)控植物生長物質的化學本質開展深入研究，1969年Voinove-Raikova等[24]報道淡紫擬青霉可產(chǎn)生IAA；Leverone等[25]提出該IAA與玉米種子貯藏蛋白結合；楊婷等[26]認為淡紫擬青霉PL-HN-16促進小麥胚芽鞘生長的活性因子為分子量約14 kDa的蛋白質；林茂孫等[27]報道對大豆種子均有明顯刺激萌發(fā)和生長作用的是淡紫擬青霉濾液中12 kDa和28 kDa蛋白組分，推測某種生理活性物質與蛋白質呈結合態(tài)存在于培養(yǎng)濾液中。可見，淡紫擬青霉具有防止線蟲和促進植物生長的雙重功能，其培養(yǎng)液中促生物質的化學本質雖有待進一步明確，但它們對多種植物生長確有調(diào)控作用，推測這種外源激素或激素類似物能誘導特異基因表達和特殊蛋白質合成。

印度芥菜（Brassica juncea L.）對 Cs[8]、Sr[9]等多種金屬具有較高的耐受性和富集能力，常作為研究重金屬脅迫的模式植物。本研究結果顯示，用ρ（Cs+）100 mg·L-1的A10發(fā)酵液（稀釋5x～55x）培養(yǎng)的印度芥菜幼苗生物量呈下降趨勢（圖6），Cs+蓄積量顯著升高（圖7）；發(fā)酵液稀釋35x時，幼苗地上部Cs+蓄積量與K+含量呈顯著的負相關性（圖8、圖9）。胡擁軍[28]的研究結果顯示，隨著重金屬砷、鉛污染濃度提高，砷超富集植物蜈蚣草、鉛超富集植物鬼針草葉片中鉛、砷含量能夠維持在較高水平或顯著增加；若添加一定濃度的IAA，則能減緩砷脅迫造成的細胞膜脂質過氧化損傷。葉和松[29]報道顯示，水培條件下菌株發(fā)酵液中的生物表面活性劑能明顯提高土壤和發(fā)酵液中有效態(tài)重金屬鉛、錫的濃度，顯著提高植物根部的相對電導率，從而促進植物對鉛、錫的吸收。張婷[30]研究結果表明，Cd脅迫下添加植物激素能夠促進油菜的生長發(fā)育，促進植物根系吸收和富集Cd并向地上部轉移。植物激素聯(lián)合螯合劑的處理能有效地緩解土壤中Cd對油菜植株生長發(fā)育的脅迫，促進油菜對Cd的吸收富集，提高油菜對土壤中Cd的提取效率。本文結果顯示，隨著培養(yǎng)基中Cs+濃度增加，A10分泌的IAA類似物含量顯著增加（圖4），A10發(fā)酵液稀釋35x時印度芥菜幼苗對Cs+的蓄積量顯著增加（圖7），因此推測A10發(fā)酵液中IAA類似物等活性物質能夠緩解Cs+脅迫，有利于幼苗生長及其對Cs+吸收蓄積。研究表明，一些菌根真菌（如叢枝菌根）一方面可通過與宿主植物形成共生體，改變植物根細胞的滲透性，增強植物對土壤養(yǎng)分的吸收，提高植物對環(huán)境的適應能力[31]；另一方面，叢枝菌根的根毛和菌絲形成網(wǎng)狀結構，增加吸收面積，進而提高植物對礦質元素的吸收[32]。本研究中A10具有溶解土壤中難溶性磷鹽、鉀鹽的功能，應有利于增強印度芥菜幼苗對磷、鉀等礦質元素的吸收，從而緩解Cs+脅迫。

4 結論

（1）淡紫擬青霉A10具有較顯著的溶磷、解鉀、產(chǎn)IAA類似物等植物促生特性；較高濃度的Cs+處理下A10的解鉀能力有所增強，但其溶磷能力顯著減弱；外源Cs+和色氨酸可顯著誘導A10分泌IAA類似物。

（2）用A10發(fā)酵液的稀釋液培養(yǎng)印度芥菜幼苗，對幼苗根的生長表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制的雙重效應，這是由于A10產(chǎn)生和分泌IAA類似物所致；不同稀釋倍數(shù)（5x～55x）的A10發(fā)酵液中Cs+含量為100 mg·L-1時，幼苗生物量顯著下降；用稀釋35x的A10發(fā)酵液（Cs+含量為25～100 mg·L-1）培養(yǎng)幼苗時，幼苗地上部和地下部Cs+蓄積量顯著增加，地上部Cs+蓄積量與K+含量呈顯著的負相關性。