周樂波，王雪晶，丁雪冰，姜曉懿，滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種進展性、致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以錐體束、腦干和脊髓前角中選擇性的運動神經(jīng)元變性為特征。臨床上較為少見，主要表現(xiàn)為進行性加重的骨骼肌萎縮、無力、肌束顫動、延髓麻痹及錐體束征[1]。ALS發(fā)病率約為1.5/10萬，病情進展較快，目前尚無有效的治療手段，患者生存質(zhì)量較差，預(yù)后不良，大部分生存期只有3～5 a[2]。運動神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞中TAR DNA結(jié)合蛋白43(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)聚集物(包涵體)是ALS的特異性病理特征，TDP-43包涵體呈泛素(ubiquitin,Ub)陽性，無法正常降解[3]。既往研究[4-7]描述了ALS患者萎縮肌肉的電生理學(xué)特點，目前對于ALS患者肌肉組織中異常蛋白聚集物的研究仍較少。為此，該研究通過肌肉活檢術(shù)，檢測ALS患者骨骼肌組織及其神經(jīng)末梢中磷酸化TDP-43(pTDP-43)和Ub的表達情況，探討早期肌肉組織受累在ALS發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2012年3月至2018年6月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的ALS患者30例， 均符合1999年修訂的Airlie House診斷標準[8]及2008年補充的Awaji-Shima標準[9]，無其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。22例對照為在該院外科接受手術(shù)治療的非神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及其他慢性疾病患者。本研究通過鄭州大學(xué)及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，獲得所有受試者和(或)其家屬知情同意并簽署骨骼肌活檢知情同意書。對所有受試者進行全面的病史采集，包括年齡、性別、癥狀、起病部位、病情進展程度、肌電圖、家族史、生活環(huán)境、工作性質(zhì)、吸煙飲酒史、中毒史、外傷史、神經(jīng)系統(tǒng)病變危險因素接觸史、其他慢性疾病史等。30例ALS患者均經(jīng)隨訪、體格檢查及神經(jīng)電生理檢查確診，男19例，女11例；年齡24～80(54.7±13.4)歲，發(fā)病至確診時間5～20個月；以單上肢起病者1例，雙上肢3例，單下肢4例，雙下肢5例，四肢8例，偏側(cè)肢體2例，以延髓麻痹癥狀起病者3例，延髓麻痹+上肢3例，延髓麻痹+上肢+下肢1例；肌電圖均提示神經(jīng)源性損害，5例有家族史。22例對照均排除神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，男13例，女9例，年齡28～72(48.5±13.0)歲。

1.2肌肉組織取材選取受試者一側(cè)上臂，分別于肱二頭肌、肱三頭肌、三角肌對應(yīng)處用記號筆做好切口標記，碘伏溶液常規(guī)消毒，鋪孔巾，20 g/L利多卡因于定位處做逐層浸潤麻醉后，左手固定皮膚，右手持手術(shù)刀在擬取材處垂直進刀，沿肌纖維縱行方向分別做約3 cm長的切口，鈍性分離，充分暴露肌肉組織，用血管鉗游離肌束，切取肌束(長0.5～1.0 cm，直徑0.3～0.5 cm)，平均分為兩部分，分別置于40 g/L多聚甲醛中固定及液氮低溫凍存。取材完成后壓迫止血、清理創(chuàng)面、縫合切口、消毒、無菌紗布加壓包扎，8 d后拆線。

1.3肌肉組織HE及酶組織化學(xué)染色取出浸泡于40 g/L多聚甲醛內(nèi)的肌肉組織標本，常規(guī)梯度乙醇脫水，經(jīng)石蠟包埋制成蠟塊，用石蠟切片機連續(xù)切片，厚度4 μm。取出低溫凍存的肌肉組織，用冰凍切片機連續(xù)切片，厚度15 μm。

1.3.1 HE染色 蘇木精液10 min，流水洗，10 g/L鹽酸乙醇分化10 s；10 g/L伊紅0.5～1.0 min，流水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌纖維大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

1.3.2 ATP酶染色 常規(guī)ATP酶染色均在室溫下進行，準備0.01 mol/L巴比妥鈉4 mL、0.18 mol/L氯化鈣4 mL、蒸餾水12 mL；標定酸、堿之后倒入染色小缸，將切片分別放入3種不同pH值(分別為10.40、4.65和4.30)的預(yù)孵育液內(nèi)，室溫下10 min；0.18 mol/L氯化鈣10 min內(nèi)洗3次，20 g/L氯化鈷3 min，0.01 mol/L 巴比妥鈉洗3次，10 g/L硫化銨30 s，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌纖維類型、分布等。

1.3.3 還原型輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶(NADH-TR)染色 配制反應(yīng)液：將8 mg還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、10 mg硝基四唑氮藍、10 mL 0.2 mol Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)混勻后加入1 mL二甲基亞砜，然后用玻璃棒攪拌2～3 min，過濾后使用。將切片于反應(yīng)液內(nèi)37 ℃孵育35 min，丙酮清洗，蒸餾水沖洗，自然干燥，封片。顯微鏡下觀察肌纖維大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)及類型、分布等，數(shù)碼相機拍照。

1.4神經(jīng)末梢中pTDP-43和Ub表達的免疫組化檢測石蠟切片烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，置于枸櫞酸鈉緩沖液中行高溫高壓抗原修復(fù)5 min。胰蛋白酶消化，PBS洗滌，滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液(鼠抗pTDP-43抗體購自 Millipore 公司，按1∶300稀釋；鼠抗Ub抗體購自Santa Cruz公司，按1∶500稀釋)，4 ℃ 過夜。室溫下復(fù)溫，PBS洗滌3遍。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(羊抗鼠IgG，購自博奧森公司)，孵育30 min，PBS洗滌3遍。DAB顯色3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌細胞形態(tài)及著色情況，數(shù)碼相機拍照。若胞質(zhì)和胞核有棕褐色或棕黃色、粗糙顆粒狀著色則記為陽性染色，計算陽性表達率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，兩組肌肉組織中 pTDP-43和Ub陽性表達率的比較均采用Fisher精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組骨骼肌肌肉組織HE及酶組織化學(xué)染色結(jié)果鏡下可見ALS患者肌肉組織肌纖維大小不等，散在萎縮的小角形纖維，小群萎縮、大組狀萎縮纖維，肌膜核增多，ATP酶染色可見兩型肌纖維萎縮、同型群組化現(xiàn)象，NADH-TR染色可見靶纖維等特征性病理表現(xiàn)；對照組無上述表現(xiàn)(圖1)。

2.2兩組骨骼肌神經(jīng)末梢中pTDP-43和Ub陽性表達率的比較鏡下可見ALS患者骨骼肌神經(jīng)末梢中散在分布pTDP-43及Ub陽性染色細胞(圖2、3)。22例對照肌肉組織中未檢出pTDP-43及Ub表達；14例(46.7%)ALS患者pTDP-43陽性表達，18例(60.0%)Ub陽性表達；兩組比較，P均<0.001。

A:ALS組;B:對照組;1:HE染色(×100);2、3:ATP酶染色(×40);4:NADH-TR染色(×100)

A:ALS組;B:對照組;1、2:肌纖維;3、4:骨骼肌神經(jīng)末梢

A:ALS組;B:對照組

3 討論

ALS是一種累及錐體束、腦干運動神經(jīng)核及脊髓前角細胞的慢性進行性變性疾病，其病因及發(fā)病機制不明。ALS的病理學(xué)標志是運動神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)散在分布的Ub陽性異常束狀蛋白聚集、顆粒樣物質(zhì)和球狀包涵體，TDP-43是其核心成分[3]。以ALS為代表的TDP-43 蛋白沉積為病理特征的一組疾病統(tǒng)稱為TDP-43蛋白病[10]。Ub陽性包涵體是神經(jīng)變性疾病的病理特征之一，如阿爾茨海默病的神經(jīng)纖維纏結(jié)、帕金森病的路易小體及亨廷頓病的亨廷頓蛋白包涵體均為Ub免疫反應(yīng)陽性。在ALS患者的脊髓、腦干、運動皮層的運動神經(jīng)元及海馬神經(jīng)元中均分布有Ub陽性包涵體。既往有研究[11]表明，Ub-蛋白酶體系統(tǒng)(Ub-proteasome system, UPS)可能與ALS發(fā)病機制有關(guān)，UPS異常可導(dǎo)致ALS患者TDP-43蛋白異常聚集。

目前認為，ALS的發(fā)病源于運動神經(jīng)元的損害，繼發(fā)產(chǎn)生失神經(jīng)性肌肉萎縮。電生理學(xué)研究[7]證實，ALS患者的肌肉表現(xiàn)為異常的自發(fā)活動、運動單位募集減少、運動單位數(shù)量減少、傳導(dǎo)速度減慢、復(fù)合肌肉動作電位兩側(cè)不對稱、慢性重復(fù)刺激衰減等。病理組織學(xué)研究[6]證實，ALS患者的肌肉組織具有多重病理學(xué)改變，包括靶纖維、群組化現(xiàn)象，纖維壞死和炎癥，DNA片段化與促凋亡蛋白的表達等。然而，關(guān)于ALS患者肌肉組織中pTDP-43沉積的病理研究較少。有學(xué)者[12]對30例ALS患者進行股四頭肌活檢術(shù)，未檢測到pTDP-43沉積。另有學(xué)者[13]于ALS患者腓腸肌中檢測出Ub結(jié)合蛋白P62陽性而pTDP-43陰性的蛋白包涵體。研究[6]發(fā)現(xiàn)，33.3%的ALS患者肌肉組織中可檢測出pTDP-43和P62陽性包涵體，尤以軸向骨骼肌(椎旁肌、膈肌)為甚。本研究中作者檢測了ALS患者骨骼肌神經(jīng)末梢中pTDP-43和Ub的表達情況，結(jié)果顯示，46.7%(14/30)的ALS患者三角肌、肱二頭肌、肱三頭肌的神經(jīng)末梢中pTDP-43陽性表達，60.0%(18/30)的ALS患者Ub陽性表達。本研究中的pTDP-43陽性表達率與以往研究[6]報道的陽性表達率(33.3%)相比稍高，可能與入組病例數(shù)較少、檢測肌肉部位不一致以及抗體特異性和靈敏度不一有關(guān)。此外，活檢采取受試者的少量肌肉組織樣本，取材的范圍非常有限。

既往研究[4-5]亦證實，ALS轉(zhuǎn)基因模型鼠的骨骼肌內(nèi)具有多重病理表現(xiàn)。Atkin等[4]在ALS轉(zhuǎn)基因模型鼠的腓腸肌、比目魚肌和指長屈肌檢測到可溶性超氧化物歧化酶-1蛋白聚集體。Wong等[5]發(fā)現(xiàn)只在骨骼肌中表達人類SOD1-G37R和SOD1-G93A的轉(zhuǎn)基因小鼠，其神經(jīng)組織中不表達上述突變蛋白，最終亦可發(fā)展成為ALS，致使其運動神經(jīng)元受累、形成Ub陽性包涵體。上述研究為骨骼肌參與ALS發(fā)病這一理論提供了更為直接的證據(jù)。

ALS患者骨骼肌神經(jīng)末梢中pTDP-43包涵體的產(chǎn)生及形成可能有多種機制。首先，可能是由于ALS患者肌細胞及神經(jīng)纖維自噬-溶酶體系統(tǒng)和UPS損傷，導(dǎo)致TDP-43降解異常。自噬-溶酶體系統(tǒng)和UPS是真核細胞蛋白降解的重要途徑。既往研究[14]表明，TDP-43降解途徑包括自噬-溶酶體系統(tǒng)和UPS。P62是一種多功能Ub結(jié)合蛋白，參與自噬-溶酶體系統(tǒng)和UPS兩種蛋白降解過程。Mizuno等[14]在28例ALS患者中觀察到27例前角細胞中具有P62陽性包涵體。王建宇[15]通過對ALS患者骨骼肌標本行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)萎縮肌纖維內(nèi)肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，肌膜下溶酶體、線粒體聚集，可見次級溶酶體和自噬小泡。研究[16]發(fā)現(xiàn)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織自噬相關(guān)標記物表達上調(diào)。分析自噬-溶酶體系統(tǒng)可能參與了ALS骨骼肌病變過程，但其作用機制仍待進一步研究。Gilchrist等[17]將野生型Ub(H6Ub)和突變型Ub(H6UbK48R)分別轉(zhuǎn)入ALS小鼠中，發(fā)現(xiàn)表達H6UbK48R的轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病延遲，說明Ub的改變可影響ALS的進展。因此，自噬-溶酶體系統(tǒng)和UPS的功能異常可能參與了ALS 骨骼肌病變過程。另一可能機制是TDP-43在細胞間朊蛋白樣播散，即通過順軸突轉(zhuǎn)運。有學(xué)者[18]用神經(jīng)元-神經(jīng)元跨突觸播散理論來解釋pTDP-43在腦和脊髓中的病理學(xué)播散，推測pTDP-43沿著運動神經(jīng)元的軸突播散至神經(jīng)肌肉接頭。

綜上所述，該研究結(jié)果提示除運動神經(jīng)元、非運動神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞以外，骨骼肌神經(jīng)末梢可能是部分ALS患者pTDP-43病理沉積的又一部位。然而目前我國相關(guān)研究較少，而且也缺乏較為完整的流行病學(xué)資料，因此還需要更大樣本量、部位更廣泛的骨骼肌病理學(xué)研究去進一步證實。