張世甲，李 劍，韓廣森

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科 鄭州 450008

胃癌是一種世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤。胃腺癌是由胃腺體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成，發(fā)病機(jī)制涉及一系列基因的調(diào)控作用，這些基因可以影響細(xì)胞的多種生物學(xué)特性[1-2]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子J1(forkhead box J1，F(xiàn)OXJ1)是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與纖毛形成、胚胎發(fā)育、自身免疫等過(guò)程。FOXJ1在不同腫瘤組織中的作用不同，其在肝癌中可能發(fā)揮促癌作用，而在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中可能發(fā)揮抑癌作用[3-6]。目前的研究[7-8]顯示，F(xiàn)OXJ1在胃癌組織中表達(dá)減弱，上調(diào)其表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能。本研究探討了過(guò)表達(dá)FOXJ1對(duì)胃腺癌細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑FOXJ1過(guò)表達(dá)慢病毒(Lv-FOXJ1)和陰性對(duì)照慢病毒(Lv-NC)由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司構(gòu)建；胃腺癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自美國(guó)ATCC；Frist Strand cDNA Synthesis購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa；引物由金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；激活型Caspase-3(C-Caspase-3)抗體、細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)抗體、激活型Caspase-9(C-Caspase-9)抗體購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；JC-1法線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將SGC-7901細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞融合度達(dá)30%左右開(kāi)始慢病毒感染。用Opti-MEM稀釋病毒液(MOI=50)，將病毒液添加到細(xì)胞中，同時(shí)加入Polybrene(終濃度為5 μg/mL)，混合，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)72 h，用4 μg/mL嘌呤霉素篩選10 d，收集細(xì)胞。穩(wěn)定感染Lv-FOXJ1和Lv-NC的SGC-7901細(xì)胞記為FOXJ1組和陰性對(duì)照組，設(shè)置不感染慢病毒的SGC-7901細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.3細(xì)胞中FOXJ1mRNA的檢測(cè)取各組細(xì)胞，添加Trizol(每個(gè)6孔板內(nèi)加入1 mL)，冰上靜置5 min，按照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，用First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s(1個(gè)循環(huán))；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：FOXJ1-F為5’-TGGATCACGGACAACTTCTGC TA-3’，F(xiàn)OXJ1-R為5’-CACTTGTTCAGAGACAGGT TGTGG-3’；內(nèi)參β-actin-F為5’-GAGCTACGAGCT GCCTGACG-3’，β-actin-R為5’-CCTAGAAG CATTTGCGGTGG-3’。用2-ΔΔCt法計(jì)算FOXJ1 mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞中FOXJ1蛋白的Westernblot法檢測(cè)取各組細(xì)胞，添加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解，用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白樣品中添加5×上樣緩沖液，98 ℃加熱10 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min，-20 ℃保存。配制100 g/L積層膠和8 g/L分離膠，每個(gè)泳道上樣50 μg，100 V電壓電泳，直至溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠底部。用半干法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上(25 mA，轉(zhuǎn)膜30 min)，將NC膜放在50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉2 h，加鼠抗人FOXJ1抗體(1∶600)、鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶2 000)在室溫孵育1 h，ECL顯色。內(nèi)參為β-actin。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞存活率的檢測(cè)取各組細(xì)胞種植到96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2 d以后取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL的MTT培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)液體，加150 μL的DMSO于搖床上振蕩反應(yīng)10 min。用酶標(biāo)儀比色，參比波長(zhǎng)為490 nm。設(shè)置空白孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6克隆形成能力的檢測(cè)取各組細(xì)胞接種在10 mL的培養(yǎng)皿中，每皿200個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，14 d可觀察到細(xì)胞克隆出現(xiàn)。多聚甲醛固定后，吉姆薩染色20 min，室溫條件下干燥，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)≥50個(gè)的克隆數(shù)目，以克隆數(shù)目與接種細(xì)胞數(shù)目的百分比表示克隆形成率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)取各組細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷后的PBS洗滌2次，加400 μL結(jié)合緩沖液，再加5 μL PI、5 μL Annexin V-FITC，避光條件下孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8胞漿中CytC和細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白的檢測(cè)取各組細(xì)胞，提取胞漿中的總蛋白，用Western blot法檢測(cè)Cyt C蛋白水平，同時(shí)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平；C-Caspase-3、C-Caspase-9抗體均以1∶600稀釋?zhuān)襟E同1.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9線粒體膜電位的JC-1法檢測(cè)取各組細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸液，用PBS重懸3次，加JC-1染色液于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，用冰預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次，添加1 mL的DMEM，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。正常細(xì)胞中JC-1聚集在線粒體中產(chǎn)生紅色熒光，凋亡細(xì)胞內(nèi)JC-1以單體的形式聚集在胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光。計(jì)算紅色熒光和綠色熒光的比值，以此比值作為線粒體膜電位水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0分析，3組細(xì)胞上述各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞中FOXJ1表達(dá)水平的比較FOXJ1組細(xì)胞中FOXJ1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：FOXJ1組

組別nFOXJ1 mRNAFOXJ1蛋白空白對(duì)照組31.00±0.080.21±0.02陰性對(duì)照組30.98±0.130.20±0.06FOXJ1組31.96±0.23?0.38±0.04?F37.05516.446P<0.0010.004

*：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.2 3組細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較FOXJ1組細(xì)胞存活率和克隆形成率低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較

*：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 3組細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-9表達(dá)水平的比較FOXJ1組細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

2.4 3組細(xì)胞線粒體膜電位及胞漿中CytC表達(dá)水平的比較FOXJ1組細(xì)胞線粒體膜電位低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，胞漿中Cyt C蛋白水平高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3和表4。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：FOXJ1組

組別nC-Caspase-3C-Caspase-9細(xì)胞凋亡率/%空白對(duì)照組30.13±0.020.19±0.023.99±0.35陰性對(duì)照組30.12±0.050.20±0.044.12±0.47FOXJ1組30.35±0.04?0.32±0.03?24.58±3.76?F33.80016.24187.278P<0.0010.004<0.001

*：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，P<0.05

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：FOXJ1組

*：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

FOXJ1基因定位于染色體17q22～q25，屬于FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員。FOXJ1蛋白由403個(gè)氨基酸組成，含有轉(zhuǎn)錄激活域、核定位序列、DNA結(jié)合域。當(dāng)受到多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等外界信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的FOXJ1被激活，與靶基因上的KTTT GTTGTTKTW或者HWDTGTTTGTTTA序列結(jié)合(其中W表示A或T，H為非G，D為非C，K表示G或者T)，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，目前對(duì)于FOXJ1調(diào)控轉(zhuǎn)錄的具體機(jī)制尚不明確[9-11]。FOXJ1具有多種功能，參與免疫細(xì)胞如T細(xì)胞活化等過(guò)程，參與細(xì)胞內(nèi)炎癥因子、黏附分子、趨化分子等的表達(dá)調(diào)控，在脊椎動(dòng)物纖毛、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)分化等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-14]。研究[4-5,15]證實(shí)FOXJ1參與腫瘤的發(fā)生，在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同；目前在人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)FOXJ1基因異常高甲基化，而在肝癌細(xì)胞中FOXJ1表達(dá)水平升高。

最近的研究[7-8,16]顯示，F(xiàn)OXJ1在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用；上調(diào)胃癌細(xì)胞中FOXJ1的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲能力降低，胃癌細(xì)胞分解細(xì)胞外基質(zhì)的能力也下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)FOXJ1的胃腺癌細(xì)胞凋亡率升高，同時(shí)細(xì)胞克隆形成能力和存活能力降低，提示過(guò)表達(dá)FOXJ1具有抑制胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡的作用，其在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、線粒體途徑、死亡受體途徑等，線粒體途徑是最為經(jīng)典的細(xì)胞凋亡機(jī)制。線粒體釋放Cyt C和線粒體外膜通透性增加是線粒體途徑凋亡發(fā)生的關(guān)鍵。線粒體膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放可導(dǎo)致線粒體膜電位下降，存在于線粒體內(nèi)的Cyt C可進(jìn)入到胞質(zhì)中。Cyt C具有激活Caspase-9的作用。Caspase-9是Caspase凋亡反應(yīng)的上游因子，其活化可以迅速激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活位于凋亡反應(yīng)下游的Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17-19]。Caspase-3和Caspase-9在正常細(xì)胞中以沒(méi)有活性的酶原形式存在，C-Caspase-3、C-Caspase-9分別是Caspase-3和Caspase-9的活化形式，二者是細(xì)胞凋亡發(fā)生的直接參與因子[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)FOXJ1的胃腺癌細(xì)胞線粒體膜電位下降，同時(shí)細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平升高，胞漿中Cyt C蛋白水平升高，提示FOXJ1可能通過(guò)激活線粒體途徑誘導(dǎo)Caspase凋亡反應(yīng)，從而促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，高表達(dá)FOXJ1可以抑制胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，凋亡誘導(dǎo)機(jī)制與線粒體途徑有關(guān)。這對(duì)于研究FOXJ1在腫瘤發(fā)生中的具體機(jī)制，對(duì)于闡明胃腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。