劉廣志　陳炳佑　侍福梅

摘要：以擬南芥野生型、GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥及微管結合蛋白MAP18相關突變體為材料，利用藥理學試驗及激光掃描共聚焦顯微技術研究了在脫落酸（ABA）誘導葉片氣孔關閉過程中保衛(wèi)細胞微管骨架的動態(tài)變化、根生長情況及其可能的調控因子。結果表明，微管結合蛋白MAP18過表達擬南芥OE的葉片氣孔關閉現(xiàn)象敏感，MAP18 RNAi沉默株R18現(xiàn)象相對不敏感。外源ABA抑制擬南芥幼苗初生根的生長試驗中，突變體OE根伸長減慢的現(xiàn)象顯著，伸長速率由0.60 cm/d降低至0.12 cm/d，未處理時WT、map18的伸長速率都要低于OE的伸長速率，而用5 μmol/L ABA處理之后，WT、map18的伸長速率高于OE的伸長速率。在此基礎上研究了參與其中的作用因子，推測MAP18通過影響微管的動態(tài)重組參與到ABA誘導擬南芥氣孔關閉和根伸長的生理過程。

關鍵詞：MAP18；擬南芥；脫落酸；氣孔；幼根；微管結合蛋白

中圖分類號： Q945文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0055-03

收稿日期：2014-12-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：31240035）；山東省自然科學基金（編號：ZR2010CQ002）。

作者簡介：劉廣志（1989—），男，山東聊城人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。 E-mail：liuguangzhi_568@163.com。

通信作者：侍福梅，博士，副教授，從事模式植物及重要農(nóng)作物環(huán)境應答的信號轉導研究。E-mail： shifumei@lcu.edu.cn。脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要植物激素，有多種生物功能，在氣孔關閉和開放[1]、側根發(fā)生[2]、初生根伸長生長[3]過程中有重要作用。微管是植物細胞骨架成分之一，在維持細胞形態(tài)與結構、參與胞內(nèi)物質運輸、信號轉導[4-5]上有重要作用?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明微管骨架的組裝與解聚在氣孔運動中發(fā)揮著作用[5-9]，并有研究報道保衛(wèi)細胞微管骨架直接參與調節(jié)氣孔運動[10]，G蛋白作為調節(jié)因子參與到氣孔運動中[11]，是否還有其他蛋白也參與其中？

微管是由微管蛋白組成，而微管蛋白在結合蛋白的影響下，進行著微管的組裝與解聚，微管結合蛋白中的MAP18是一種植物微管的去穩(wěn)定因子，可以影響周質微管的排列方式，進而影響細胞的生長[12]。MAP18在花粉的生長中起著作用[13]，并且有研究表明ABA可能通過MAP18共同調控花粉的生長[14]。本研究以擬南芥為研究對象，探討研究微管骨架在ABA誘導氣孔關閉過程中的動態(tài)變化、根伸長情況及MAP18在其中的作用，為進一步了解ABA影響氣孔運動及根生長發(fā)育的生理過程提供很多信息。

1材料與方法

1.1材料

供試植物為擬南芥野生型擬南芥WT、GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥及微管結合蛋白MAP18相關突變體：MAP18過表達植株OE、MAP18沉默株R18和MAP18 T-DNA 插入突變株map18。

1.2方法

1.2.1擬南芥的種植用75%乙醇處理野生型擬南芥、GFP-α-tubulin-6 轉基因擬南芥和相關突變型擬南芥種子2 min，0.5 %次氯酸鈉浸泡8 min，無菌水漂洗4～6次，用移液槍點播在MS培養(yǎng)基上，4 ℃放置3 d，置于溫度為（21±2） ℃、光-暗周期為14 h-10 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2微管骨架動態(tài)排布的觀察MS培養(yǎng)基中生長7 d的GFP-α-tubulin轉基因擬南芥幼苗分別在0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡30 min后，每隔15 min在激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，F(xiàn)luoView FV 1200）下觀察氣孔保衛(wèi)細胞的微管排布的變化（物鏡60×油鏡；480 nm激發(fā)光激發(fā)）。

1.2.3擬南芥氣孔的觀察將于MS培養(yǎng)基中生長7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min后，取葉片觀察下表皮氣孔的關閉情況。

1.2.4對擬南芥在ABA誘導下根生長的分析MS培養(yǎng)基中生長7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗轉移至ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L的MS培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，轉移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，幼苗生長4 d后進行拍照及長度統(tǒng)計。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L 的MS培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)野生型擬南芥和突變體4 d后，測量彎根后的長度，分析數(shù)據(jù)得出伸長速率。重復3次，每次重復20組。平均日伸長速率（cm/d）=彎根伸長長度（cm） /彎根時間（d）。

2結果與分析

2.1ABA和微管特異性藥物誘導擬南芥幼苗氣孔關閉的情況

將于MS培養(yǎng)基中生長7 d的野生型擬南芥幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min，發(fā)現(xiàn)在5 μmol/L ABA 處理下，氣孔關閉更顯著，隨ABA濃度的升高，葉片氣孔關閉越來越顯著（圖1）。為了探究微管骨架是否主動參與到ABA誘導氣孔關閉過程，用氨磺樂靈和ABA處理擬南芥幼苗葉片表皮細胞，發(fā)現(xiàn)在ABA和氨磺樂靈共同處理下，氣孔關閉更顯著（圖1-E）。

2.2ABA對氣孔保衛(wèi)細胞微管骨架的影響

對擬南芥葉片未作處理的情況下，通過激光掃描共聚焦顯微鏡可以清楚地觀察到保衛(wèi)細胞周質微管長纖維絲由細胞背壁到腹壁輻射排列（圖2-A）。隨后用5 μmol/L ABA處理擬南芥葉片，隨時間增長，越來越多的微管發(fā)生解聚（圖2-B至圖2-E），90 min后，可見氣孔關閉，其保衛(wèi)細胞微管骨架基本解聚，彌散狀熒光隨機充滿整個細胞（圖2-F）。

2.3ABA誘導微管結合蛋白MAP18相關突變體氣孔關閉情況

為了研究MAP18是否參與調控ABA誘導氣孔關閉，分別用5 μmol/L ABA處理野生型擬南芥和突變體的葉片90 min，發(fā)現(xiàn)在ABA誘導擬南芥葉片氣孔關閉過程中，野生型葉片氣孔很少完全關閉，75%的OE葉片氣孔完全關閉，R18相對來說現(xiàn)象不顯著（圖3），處于半關閉狀態(tài)。2.4ABA誘導擬南芥幼苗的彎根生長

將生長7 d的野生型和突變體幼苗轉移至含不同濃度ABA的MS培養(yǎng)基中進行彎根培養(yǎng)。如圖4-A所示，野生型及突變體在ABA濃度升高后，OE的根伸長明顯減慢，R18在ABA濃度5 μmol/L的MS培養(yǎng)基上根伸長幾乎停止。對根的伸長做數(shù)據(jù)統(tǒng)計（圖4-B），在未加ABA時OE的根伸長速率為0.60 cm/d，比WT、R18、map18的伸長速率都要高。隨著ABA的濃度升高，OE的伸長速率降低至0.12 cm/d，比WT、map18的伸長速率小。

3討論

3.1ABA誘導的葉片保衛(wèi)細胞微管骨架的解聚與重組

ABA誘導氣孔關閉作為一個經(jīng)典體系， 被廣泛關注并應用到很多試驗，并且很多證據(jù)表明，在氣孔開關運動中保衛(wèi)細胞的微管骨架組裝發(fā)生了解聚與重組[7-8，15]。ABA與微管在氣孔關閉運動中是否存在聯(lián)系尚不清楚。本試驗發(fā)現(xiàn)，正常氣孔保衛(wèi)細胞中微管骨架呈纖維狀從腹壁到背壁輻射狀排列，這與Yu等的研究結果[15]相一致。進一步用外源ABA處

理GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥葉片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ABA處理引起微管骨架的排布發(fā)生變化，整齊的輻射狀排列逐步散亂，推測微管排布的動態(tài)變化可能參與了ABA誘導氣孔關閉的信號轉導的過程。

3.2MAP18參與ABA誘導的葉片保衛(wèi)細胞微管骨架降解、根伸長減慢的過程

微管是植物細胞的骨架，在植物生理方面有許多重要作用，周質微管排列的變化顯著影響細胞形態(tài)及生長方向，在快速伸長的細胞中，周質微管以橫向排列為主，而在伸長比較緩慢或停止伸長的細胞中，周質微管以斜向或縱向排列為主[16-18]。當用ABA處理擬南芥幼苗初生根時，根生長減緩，其微管骨架也會隨之發(fā)生變化，且微管結合蛋白MAP18過表達植株OE的生長速率降低顯著，WT和突變株map18沒有OE敏感，由此推測，MAP18在ABA抑制根伸長中起著一定的促進作用。在ABA誘導氣孔關閉的試驗中，OE更敏感，MAP18 RNAi沉默株R18相對來說不敏感，推測ABA在誘導氣孔關閉中，MAP18促進ABA降解氣孔保衛(wèi)細胞微管骨架。

本研究深入探討了ABA在誘導氣孔關閉中的作用和可能的作用機制，為微管骨架參與氣孔運動提供了又一新思路；但是在ABA誘導氣孔關閉和抑制根生長過程中，MAP18如何與ABA相互作用的機制等一系列問題尚需進一步研究。

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