李肖瑛 白壽軍* 查芳芳 朱迎春

作者單位：201700 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院

完整的足細(xì)胞，包括足突和其間的裂隙膜，是維持蛋白質(zhì)濾過屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1］。足細(xì)胞數(shù)量減少，足突融合或裂隙膜蛋白表達(dá)減少都將導(dǎo)致大量蛋白尿［2-3］。足細(xì)胞數(shù)量減少也被認(rèn)為是局灶節(jié)段腎小球硬化的最關(guān)鍵致病因素之一，而局灶節(jié)段腎小球硬化是各種腎小球疾病進(jìn)展至腎小球硬化的共同途徑［4］。因此，足細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)的改變和腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作者前期工作發(fā)現(xiàn)激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號可以防止嘌呤霉素氨基核苷（PAN）誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降［5］，提示cAMP的保護(hù)作用可能與線粒體途徑有關(guān)。線粒體生物學(xué)作用包括氧化磷酸化、生成動力學(xué)、分裂/融合動力學(xué)以及線粒體基因組轉(zhuǎn)錄等，這些作用和足細(xì)胞損傷的關(guān)系尚不完全清楚。因此本研究將探討線粒體形態(tài)變化在cAMP防止足細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 條件永恒小鼠足細(xì)胞株由Peter Mundel教授贈送。足細(xì)胞培養(yǎng)簡要描述如下：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液為含10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液；條件培養(yǎng)液在上述培養(yǎng)液中再加入10IU/ml小鼠γ-IFN，促進(jìn)足細(xì)胞增殖。本研究采用15-25代足細(xì)胞。生長于I型膠元被覆培養(yǎng)皿中的細(xì)胞使用條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)于33℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中（許可條件），隔天換液。誘導(dǎo)分化時，足細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中使用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)（非許可條件），隔天換液1次。細(xì)胞在非許可條件下生長6d后，大部分細(xì)胞呈分枝狀，細(xì)胞體變大，細(xì)胞核變大顏色變淺，部分細(xì)胞出現(xiàn)雙細(xì)胞核。待細(xì)胞分化后，使用各種試劑或藥物刺激。

1.2 線粒體形態(tài)染色 細(xì)胞接種于12孔板，待分化以及藥物刺激后，使用celllight mitchondria-GFP Bacman2.0試劑（美國，Life Technology公司）直接對細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色，簡要步驟為：試劑以10μl/104細(xì)胞的量加入到12孔板的每個孔中，過夜后直接在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 透射電鏡觀察 每組標(biāo)本收集≥107個細(xì)胞，浸泡在2.5%戊二醛中4℃固定過夜，再用1.0%鋨酸作后固定，然后用LR白色樹脂包埋（英國）。超薄切片（70nm）用乙酸雙氧鈾染色后在電鏡75kV（飛利浦CM120；荷蘭）電壓下觀察。

1.4 CCK-8檢測 按照CCK-8檢測說明書（上海碧云天）操作，敘述如下：細(xì)胞接種于96孔板，分化≥6d后使用各種藥物刺激，在刺激后的96孔板中，每孔加10μl CCK-8檢測試劑，37℃孵育1h后，于450nm波長讀取吸光度，所得吸光度值即為足細(xì)胞相對含量。

1.5 Western blot分析 檢測足細(xì)胞p-Drp1、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、cleaved caspase3、caspase3蛋 白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別用兔抗人p-Drp1一抗（美國Cell Signaling Technology公司，1∶1000），兔抗人Drp1一抗（美國Cell Signaling Technology公司，1∶1000），兔抗人Fis1一抗（美國，Alexis生物化學(xué)公司，1∶500），兔抗大鼠OPA1一抗（英國Abcam公司，1∶1000），兔抗人Mfn1一抗（英國Abcam公司，1∶1000），兔抗人cleaved caspase 3一抗（美國Cell Signaling Technology），1∶1000），兔抗人caspase 3一抗（美國Cell Signaling Technology），1∶ 1000）4℃孵育過夜，山羊抗兔熒光二抗（美國LI-COR，1∶5000）室溫孵育1h，紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Odyssey）顯影后用Image J軟件分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較使用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cAMP信號防止PAN誘導(dǎo)的線粒體分裂 通過線粒體染色和透射電鏡直接觀察線粒體的形態(tài)變化，PAN 100μg/ml孵育足細(xì)胞72h，與對照組相比，線粒體較多的處于分裂狀態(tài)，而使用cAMP激動劑pCPT-cAMP（pCPT）預(yù)孵育24h后，線粒體未分裂，更多的處于融合狀態(tài)。提示cAMP信號可能通過調(diào)節(jié)足細(xì)胞內(nèi)線粒體的分裂/融合防止足細(xì)胞凋亡。

2.2 PAN通過抑制足細(xì)胞線粒體外膜Mfn1蛋白表達(dá)，抑制線粒體融合 Mfn1是線粒體外膜蛋白，主要調(diào)節(jié)線粒體外膜融合。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)PAN時間依賴性抑制足細(xì)胞Mfn1的表達(dá)。Drp1、Fis1是調(diào)節(jié)線粒體分裂的蛋白，OPA1是線粒體內(nèi)膜蛋白，主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜融合，如圖2，發(fā)現(xiàn)PAN并不影響Drp1、Fis1、OPA1的表達(dá)，提示PAN可能通過抑制Mfn1的表達(dá)，從而抑制線粒體融合。

圖2 PAN不影響足細(xì)胞中p-Drp1、OPA1、Fis1的表達(dá)

圖3 PKA信號促進(jìn)足細(xì)胞中p-Drp1和Mfn1表達(dá)增多

圖4 PKA信號防止PAN誘導(dǎo)的Mfn1表達(dá)減少，并促進(jìn)足細(xì)胞中p-Drp1表達(dá)

2.3 cAMP信號促進(jìn)Drp1磷酸化和Mfn1蛋白表達(dá)，促進(jìn)線粒體融合 pCPT 100μm刺激足細(xì)胞30min、60min可以直接促進(jìn)足細(xì)胞生成p-Drp1，刺激24h、48h還可以直接誘導(dǎo)Mfn1表達(dá)上升，如圖3。PAN和pCPT共同作用于足細(xì)胞依然可以誘導(dǎo)p-Drp1生成，pCPT 100μm預(yù)處理24h還可以防止PAN誘導(dǎo)的Mfn1表達(dá)下降，如圖4。提示cAMP信號可能通過促進(jìn)Drp1磷酸化和Mfn1蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)線粒體融合。

2.4 線粒體分裂/融合直接調(diào)節(jié)足細(xì)胞凋亡 為了證實足細(xì)胞凋亡和線粒體分裂/融合的關(guān)系，使用花生四烯酸（Ara）和Mdivi-1兩個試劑，它們能分別誘導(dǎo)線粒體分裂和融合。Ara時間依賴性誘導(dǎo)足細(xì)胞數(shù)量下降和cleaved caspase3表達(dá)上升，而且可以完全阻斷pCPT的保護(hù)作用。對照組、PAN組、Ara組、pCPT+PAN組、pCPT+PAN+Ara組 吸 光 度分 別 為（1.01±0.08）、（0.67±0.07）、（0.37±0.03）、（0.87±0.06）、（0.36±0.03），P＜0.05。Mdivi-1 可 以部分緩解PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞數(shù)量下降，對照組、PAN組、Mdivi-1（10μM）+PAN 組、Mdivi-1（50μM）+PAN組吸光度分別為（0.76±0.02）、（0.48±0.01）、（0.51±0.01）、（0.51±0.01），P＜0.05。Mdivi-1 也可以部分防止PAN誘導(dǎo)的cleaved caspase3表達(dá)上升。見圖 5、6。

圖5 Ara誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡（注：A、C：CCK-8檢測足細(xì)胞數(shù)量；B、D：western blot檢測足細(xì)胞cleaved caspase3表達(dá)變化。與對照組比較，?P＜0.05；與PAN組比較，#P＜0.05；與pCPT+PAN組比較，▲P＜0.05）

圖6 Mdivi-1部分緩解PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡（注：A：CCK-8檢測足細(xì)胞數(shù)量；B：western blot檢測足細(xì)胞cleaved caspase3表達(dá)變化。與對照組比較，?P＜0.05；與PAN組比較，#P＜0.05）

3 討論

線粒體是細(xì)胞有氧代謝的中心環(huán)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧簇的重要來源，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、分化、生存/凋亡的一個重要的細(xì)胞器［6-8］。線粒體損傷時，線粒體完整性被破壞可導(dǎo)致多種促凋亡因子包括細(xì)胞色素C的釋放，最終引起細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿是一個關(guān)鍵性步驟，細(xì)胞色素C與胞質(zhì)中的細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，直接激活caspase 9，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［9］。

線粒體是高度動態(tài)的細(xì)胞器，并且處于分裂與融合的重復(fù)周期［10］。促進(jìn)線粒體分裂和抑制線粒體融合可以導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，凋亡以及線粒體膜電位下降。線粒體分裂和融合平衡紊亂可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，這也是心衰過程中心肌細(xì)胞丟失的重要機(jī)制［10］。

作者發(fā)現(xiàn)，PAN刺激的足細(xì)胞與正常對照組相比，其線粒體較多的處于分裂狀態(tài)，而pCPT預(yù)處理的足細(xì)胞線粒體較多的處于融合狀態(tài)。通常線粒體分裂意味著細(xì)胞需要更多的ATP或者是清除受損的線粒體。雖然線粒體分裂由Drp1啟動，但是并未發(fā)現(xiàn)Drp1水平在PAN刺激的足細(xì)胞中有所上升。Mfn1是維持線粒體外膜融合的蛋白，PAN刺激后Mfn1表達(dá)下降，提示PAN通過抑制線粒體融合，從而促進(jìn)了足細(xì)胞線粒體的分裂，那么足細(xì)胞內(nèi)的線粒體在PAN作用下增加分裂可能是一個被動的過程。線粒體融合過程可以促進(jìn)正常線粒體將完整的組成成分提供給受損線粒體，包括DNA和蛋白質(zhì)，從而維持正常的線粒體功能，防止線粒體外膜破損以及凋亡因子釋放。過多的分裂的線粒體將削弱細(xì)胞對于損傷因子的防護(hù)和修復(fù)能力，因此增加了細(xì)胞的凋亡或死亡。

PKA可以磷酸化Drp1蛋白的絲氨酸637位點，磷酸化的Drp1從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致線粒體融合，同時抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，pCPT誘導(dǎo)足細(xì)胞Drp1絲氨酸637位點磷酸化作用未受到PAN的影響。同時，pCPT還誘導(dǎo)了Mfn1表達(dá)上升。提示cAMP信號不僅可以通過增加Drp1磷酸化促進(jìn)線粒體融合，而且可以通過恢復(fù)Mfn1的表達(dá)防止PAN誘導(dǎo)的線粒體分裂。因此，cAMP可能從主動和被動兩種方式，促進(jìn)了足細(xì)胞線粒體的融合，增加足細(xì)胞對于損傷的防護(hù)和修復(fù)。作者還使用了線粒體分裂誘導(dǎo)劑Ara成功誘導(dǎo)了足細(xì)胞數(shù)量減少以及cleaved caspase3表達(dá)上升，使用Mdivi-1部分抑制了PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，也提示了線粒體分裂可能與足細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究主要觀察線粒體分裂/融合與足細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。線粒體的其他功能變化也和足細(xì)胞損傷有關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)激活促進(jìn)線粒體生成的雌激素相關(guān)受體α可以防止PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷［11］。Zhu等［12］發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙介導(dǎo)了鹽皮質(zhì)激素對足細(xì)胞的損傷。線粒體途徑產(chǎn)生的反應(yīng)性氧簇是葡萄糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的最重要途徑之一。說明線粒體功能異常在足細(xì)胞損傷中具有重要作用。應(yīng)進(jìn)一步檢測PKA信號是否對于足細(xì)胞中線粒體的生成、線粒體DNA損害以及線粒體ROS產(chǎn)生存在有益的作用。

綜上所述，PAN通過誘導(dǎo)線粒體分裂導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，pCPT通過激活cAMP信號通路防止線粒體分裂，從而起到足細(xì)胞保護(hù)作用。