孫瑤 李彥 施谷平 潘歡 趙慧云 司馬國旗*

作者單位： 314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院暨嘉興學院醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院

文獻表明［1-2］鉑絡合物作用于耳蝸，導致抗氧化物質減少、活性降低，氧自由基活動增加以及抗氧化酶類的活性喪失等原因是其耳毒性的重要因素之一。另一方面，鉑絡合物作用于靶目標耳蝸毛細胞，啟動凋亡基因，誘導程序化死亡也是導致其耳毒性重要理論之一［3］。氨磷?。╝mifostine，AMF）作為世界上第一個被認可的廣譜細胞保護劑，已經廣泛應用于減弱化療所致的毒副作用。AMF屬于胺基硫醇類。其分子機制主要表現(xiàn)為誘導組織低氧、轉移并清除自由基以及增強DNA穩(wěn)定性等［4］，這恰巧與鉑絡合物所致耳毒性機制相符合。作者通過本臨床研究探討AMF抗奈達鉑耳蝸氧化損傷的臨床療效及調控Caspase-3表達的作用機制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 根據(jù)入組標準將本院 2017年1月至12月擬行奈達鉑聯(lián)合伊立替康（IN）方案化療的肺癌術后患者140例按意愿分為觀察組（90例）和對照組（50例）。140例患者中男95例，女45例；年齡 37～74歲，平均（62.7±14.9歲）。對照組患者行IN方案化療，觀察組患者在行IN方案化療的基礎上加用AMF。入組標準：（1）非小細胞肺癌術后需行IN方案化療的初治患者（連續(xù)規(guī)律化療≥6個周期）；（2）除外曾因罹患其他系統(tǒng)腫瘤行化療患者；（3）除外存在感染性疾病、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、活動性肝炎及其他肝性疾病者；（4）除外短期內（6個月內）曾服用耳毒性藥物患者；（5）除外曾罹患耳部疾病患者；（6）除外研究開始首次行畸變產物耳聲發(fā)射（DPOAE）檢測聽力異?；颊?。排除標準：（1）因各種原因未按療程完成化療患者（化療＜6個周期或未連續(xù)規(guī)律化療）；（2）研究期間使用耳毒性藥物患者；（3）失訪患者。兩組患者性別、年齡、腫瘤分期之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 評價指標 （1）功能學：對觀察組及對照組患者在化療前后分別行DPOAE檢測，檢測患者雙耳1000～8000Hz的 DPOAE聽力圖（Madsen CAPELLA）。選擇初始純音f1和f2，使f2/f1=1.22，強度差L1-L2=10dB SPL，DPOAE 幅值超過本底噪聲3dB以上為檢出標準，測試頻率 f0［f0=（fl×f2）/2］分別為1、2、4、6、8kHz處的信噪比（dB SN）差值。同時評估兩組患者化療后耳部聽力臨床癥狀，特別注意耳鳴或耳部悶脹感的患者。（2）血清學：采用脂質過氧化產物MDA、自由基清除物T-SOD及谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX測定試劑盒（上海索寶生物科技有限公司），按使用說明檢測各組患者化療后血清相關指標活力。（3）分子生物學：采用Western-blot法對化療后兩組患者外周血中Caspase-3蛋白表達水平進行檢測。采用WB及IP細胞裂解液抽提外周血中總蛋白，并測定濃度，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴5min變性，調整上樣量，使上樣總蛋白量為30μg/孔，進行電泳。濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜，一抗（1∶1000），4℃孵育過夜；二抗（1∶2000），37℃孵育2h。充分洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，膜上加ECL工作液2ml，調整曝光時間至60s，采集圖像，并采用系統(tǒng)中自帶分析軟件測定目的條帶和內參條帶灰度值，以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值作為該樣本目的蛋白表達的相對水平進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組化療前DPOAE的dB SN差值變化 見表1。

表1 兩組患者化療前DPOAE的dB SN 差值變化［dB SN，（±s）］

表1 兩組患者化療前DPOAE的dB SN 差值變化［dB SN，（±s）］

組別 1.0kHz 2.0kHz 4.0kHz 6.0kHz 8.0kHz觀察組（n=90） 7.3±1.8 7.1±1.1 8.7±1.3 8.9±0.9 8.9±1.5對照組（n=50） 6.9±2.1 9.9±0.8 8.5±1.6 9.0±1.3 9.1±1.2 t值 1.667 1.435 1.561 1.663 1.290 P值 0.111 0.233 0.183 0.113 0.287

2.2 兩組化療后DPOAE的dB SN 差值變化 見表2。

表2 兩組患者化療后DPOAE的dB SN 差值變化［dB SN，（±s）］

表2 兩組患者化療后DPOAE的dB SN 差值變化［dB SN，（±s）］

組別 1.0kHz 2.0kHz 4.0kHz 6.0kHz 8.0kHz觀察組（n=90） 5.1±0.8 5.6±1.0 4.3±1.1 4.0±1.4 4.3±1.3對照組（n=50） 3.3±1.1 3.5±0.7 2.7±0.9 1.3±0.4 1.6±0.5 t值 1.996 2.013 2.231 2.998 2.736 P值 0.041 0.038 0.023 0.004 0.009

2.3 兩組患者血清學各指標活力值 見表3。

表3 兩組患者血清學各指標活力值（s）

表3 兩組患者血清學各指標活力值（s）

組別 MDA（nmol/ml） T-SOD（U/mol） GSH-PX（U）觀察組（n=90） 3.01±0.31 129.56±9.31 586.31±60.21對照組（n=50） 9.13±0.56 93.12±6.31 211.98±34.21 t值 2.414 2.301 2.242 P值 0.037 0.040 0.018

2.4 臨床癥狀 觀察組患者4例（4/90，4.4%）出現(xiàn)不同程度耳鳴或耳部悶脹感，明顯低于對照組16例（16/50，32.0%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.37，P=0.22）。

2.5 分子生物學檢測 外周靜脈血中，觀察組Caspase-3蛋白表達量低于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（t=2.626，P=0.013），見圖1。

圖1 Western-blot法對兩組Caspase-3蛋白檢測結果

3 討論

功能學方面，同樣接受6個周期IN方案化療的患者，觀察組出現(xiàn)耳鳴或耳部悶脹感的患者數(shù)量明顯少于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明AMF可有效緩解奈達鉑耳毒性所致的臨床癥狀，從而增加患者化療的耐受性。同時DPOAE聽力圖表明：本研究中患者在l、2、4、6、8kHz處的dB SN差值，觀察組大于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著頻率的上升，差異越大，尤其是在6、8kHz處的dB SN差值，觀察組明顯大于對照組，組間比較有顯著差異（P＜0.01），表明AMF對奈達鉑所致耳蝸氧化損傷有保護作用，且頻率愈高，保護效果愈佳，這也符合鉑絡合物致耳蝸氧化損傷“低頻-高頻”對應“頂回 -底回”的規(guī)律［5］。

研究表明，鉑絡合物可直接抑制組織的抗氧化系統(tǒng)，使抗氧化酶GSH-PX及 T-SOD的活性下降，催化氧自由基，使生物膜中的不飽和脂肪酸過氧化引起細胞損傷，并因此形成脂質過氧化產物如MDA，而AMF能逆轉改作用。本研究結果也符合了這一結論，觀察組相比對照組，T-SOD及GSH-PX活力值明顯升高，MDA活力值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此說明，AMF可通過減少耳蝸毛細胞氧自由基產生并提升其抗氧化系統(tǒng)來減少奈達鉑所致的耳毒性。

Caspase蛋白家族是細胞凋亡信號傳遞及調節(jié)的轉移因子，在其家族成員中，Caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的關鍵蛋白，負責對全部或部分關鍵蛋白進行酶切，通過激活JNK/c-JUN信號通路誘使DNA片段化，啟動細胞凋亡程序。而對AMF的研究發(fā)現(xiàn)，其活性成分游離硫醇（WR-1065）與DNA及核蛋白結合后，染色質的核小體結構發(fā)生變化，減少了核小體的降解，使化療后正常細胞凋亡現(xiàn)象明顯減少［6］。本研究也對觀察組及對照組患者外周血Caspase-3蛋白表達進行了檢測，結果表明，觀察組Caspase-3蛋白表達量低于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），間接說明觀察組細胞凋亡率低于對照組，推測AMF可通過抑制奈達鉑所致耳蝸毛細胞凋亡，減少奈達鉑所致耳毒性。但Pataer等［7］研究發(fā)現(xiàn)單用AMF誘導肺癌細胞系凋亡存在劑量相關性，說明AMF具備誘導細胞凋亡的作用，因此國內外對于AMF是否影響細胞凋亡，并以此產生對化療療效及副反應的影響尚存有爭議，值得更深入探討。