陳立新，王瑩，林楊楊，管志偉，李欽峰

（天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

增生性瘢痕發(fā)病率高，影響患者面容，甚至導(dǎo)致功能障礙，是當(dāng)前急需解決的醫(yī)療問題之一。近年來，隨著脈沖染料激光（Pulsed dye laser，PDL）廣泛應(yīng)用于臨床，學(xué)者發(fā)現(xiàn)其對各種血管性疾病有治療作用的同時，對增生性瘢痕也有一定的作用。本實驗擬通過觀察不同能量PDL照射瘢痕成纖維細(xì)胞后，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和 TGF-β3的表達(dá)情況，初步探討PDL治療增生性瘢痕的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 瘢痕成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng) 按組織塊法行人體瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液中，當(dāng)細(xì)胞生長至85%～95%融合時進(jìn)行傳代，第4～10代為實驗細(xì)胞。傳代時，按照每孔2×105～3×105的量接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)16～20 h，待細(xì)胞長成致密單層后備用。

1.2 激光照射 激光照射前，將培養(yǎng)液吸出加入PBS緩沖液，用PDL（Cynergy，可序貫發(fā)射波長595 nm的強脈沖光，脈沖寬度0.5 ms，發(fā)射頻率2 Hz，光斑直徑為5 mm）單次照射細(xì)胞株，以臨床常用能量密度 4、6、8、10、11、12 J/cm2，每個能量密度共照射 6 孔（為96孔板每行的中間6孔），并設(shè)陰性對照，激光照射時將紅紙置于培養(yǎng)皿底部以確定光束作用于全孔。照射后立即棄去磷酸基緩沖液（PBS），將細(xì)胞重新置于新鮮的DMEM生長培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 流式細(xì)胞儀測定不同能量激光照射后成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期變化 激光照射后24 h收集細(xì)胞，4℃下孵育15 min，然后用PBS沖洗2遍，再加入應(yīng)用碘化丙啶（PI）染色，室溫下染色30 min，在流式細(xì)胞儀上測定細(xì)胞周期。

1.4 激光照射完成后，將培養(yǎng)板移入37℃、5%CO2孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，ELISA法檢測不同能量PDL照射后瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1及TGF-β3的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)值間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同能量PDL照射后的細(xì)胞形態(tài) 不同能量PDL照射后，細(xì)胞形態(tài)未受明顯影響，成纖維細(xì)胞呈致密單層分布，貼壁、形態(tài)良好，分布均勻，可見樹枝狀結(jié)構(gòu)，提示細(xì)胞生長狀態(tài)良好，見圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期的檢測結(jié)果表明 不同能量激光照射后，隨著能量密度的增加，處于G0/G1期的細(xì)胞較對照組明顯增多，而S/G2M期的細(xì)胞明顯減少，見圖2。

2.3 不同能量PDL對成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響 不同能量PDL照射后，瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1濃度均下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），總體趨勢為能量越高，下降的幅度越明顯，見圖 3、4。

2.4 不同能量PDL對成纖維細(xì)胞TGF-β3表達(dá)的影響 不同能量PDL激光照射后，瘢痕成纖維細(xì)胞分泌TGF-β3濃度均上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 不同能量PDL激光組照射后細(xì)胞形態(tài)

圖2 PDL對成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

圖3 不同能量PDL照射后TGF-β1濃度變化（能量單位 J/cm2；濃度單位：pg/mL）

3 討論

PDL是當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的激光類型之一，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其對增生性瘢痕也有一定的治療作用[1-2]，但其具體機(jī)制如何尚需進(jìn)一步研究。增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的增殖和活化受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，包括TGF-β、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、白細(xì)胞介素（IL）-6、表皮生長因子（EGF）[3-5]等，其中TGF-β是目前公認(rèn)與瘢痕形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子[4]，包括 TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中，TGF-β1是一種強有力的趨化因子和刺激劑，可刺激成纖維細(xì)胞增殖，加重瘢痕的增生[6]，TGF-β2 與 TGF-β1 的生物活性相同，而TGF-β3則具有抗纖維化作用[7]。

張幸存等[8]通過研究PDL作用于兔耳增生性瘢痕的動物模型發(fā)現(xiàn)，595 nm PDL能有效抑制TGF-β1蛋白分泌水平，并最終起到治療瘢痕的目的。本實驗通過體外培養(yǎng)人瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察不同能量PDL作用于人瘢痕成纖維細(xì)胞后TGF-β1和TGF-β3的表達(dá)情況，分析PDL對增生性瘢痕起治療作用的機(jī)制，以指導(dǎo)臨床。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同能量PDL照射瘢痕成纖維細(xì)胞后，成纖維細(xì)胞的增殖受到抑制，G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增高；TGF-β1的分泌量隨激光能量的升高而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此結(jié)論與張幸存等[8]的研究結(jié)果一致，而TGF-β3的分泌量則增加，提示PDL治療增生性瘢痕的機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖、降低TGF-β1分泌量提高TGF-β3分泌量有關(guān)。

圖4 不同能量PDL照射后TGF-β3濃度變化（能量單位 J/cm2；濃度單位：pg/mL）

近年來，隨著激光醫(yī)學(xué)的發(fā)展，多學(xué)科、多位學(xué)者已經(jīng)展開了PDL對增生性瘢痕治療作用的研究。Bee等[9]通過超聲多普勒證實增生性瘢痕內(nèi)的血管較正常皮膚多，PDL可選擇性地破壞瘢痕內(nèi)的微血管，引起瘢痕可控的有限損傷，刺激機(jī)體啟動再生修復(fù)程序；郭丹鳳等[10]在研究PDL治療充血性瘢痕機(jī)理時發(fā)現(xiàn)，PDL可抑制小血管的形成并閉合小的血管，加重瘢痕組織的缺氧程度減少生長因子及成纖維細(xì)胞來源而治療瘢痕[11]；Yang等[12]和 Shi等[13]還發(fā)現(xiàn)，PDL可通過調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等其他相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到治療瘢痕的目的。

增生性瘢痕的形成及治療受多種因素的影響。本文僅對TGF-β1、TGF-β3進(jìn)行了初步探討，由于各種細(xì)胞因子有網(wǎng)絡(luò)性的特點，生物活性之間相互影響，且存在體內(nèi)與體外實驗的差異，完全確定PDL對其他細(xì)胞因子、微血管及成纖維細(xì)胞的影響，還需更加深入的研究。