劉學(xué)娟 甘海寧 張麗妹 徐學(xué)虎

引言

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指從細(xì)胞膜脫落或由細(xì)胞分泌的囊泡狀小體，幾乎可由所有細(xì)胞類型釋放。EVs 至少可分為外泌體（exosomes）和微囊泡（shed microvesicles，sMVs）2類，其中外泌體是胞內(nèi)多泡小體與質(zhì)膜融合釋放的一大類EVs，直徑約30～150 nm，而微囊泡是從質(zhì)膜直接出芽形成的EVs，直徑約50～1 300 nm。EVs 攜帶了供體細(xì)胞的癌蛋白/多肽、多種RNA（如microRNA、mRNA 和lncRNA）、脂質(zhì)和DNA片段等生物活性分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境之間的信息交流［1］。因外泌體的形成及其內(nèi)容物的分選機(jī)制更具特異性，且能在循環(huán)中相對穩(wěn)定存在等特點(diǎn)［2-4］，外泌體成為最被廣泛關(guān)注的一類EVs。

循環(huán)miRNAs 是“液體活檢”的重要組成部分，包括了游離和囊泡中miRNAs，早期研究并未嚴(yán)格區(qū)分兩者。之后的研究證實(shí)了游離miRNAs 只占少部分且不穩(wěn)定，血液中被囊泡（特別是外泌體）包裹的miRNAs 才是循環(huán)miRNAs 主要來源［5］。外泌體miRNAs 作為腫瘤基質(zhì)-腫瘤細(xì)胞間信號交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的全部生物過程［1，6］。是一類有希望的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是三大惡性腫瘤之一，我國CRC 綜合發(fā)病率和死亡率分別排第三和第五位，總體仍呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢［7-8］，缺乏敏感而特異的早期預(yù)警標(biāo)志物是CRC 發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升的重要原因。循環(huán)外泌體miRNAs 豐度較高、穩(wěn)定性好，且更容易標(biāo)準(zhǔn)化，有望成為CRC 早篩早診、病情監(jiān)測、療效評估的新型生物標(biāo)志物［9-10］。本文從循環(huán)外泌體miRNAs相關(guān)生物學(xué)特性、在CRC 中的生物標(biāo)志物作用、血液樣本收集及預(yù)處理相關(guān)注意事項(xiàng)、臨床轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)和研究局限、未來展望等幾個(gè)方面進(jìn)行論述。以期能夠?yàn)楸绢I(lǐng)域的研究者們提供參考。

1 循環(huán)外泌體miRNAs 相關(guān)生物學(xué)特性

外泌體miRNAs 在血液循環(huán)中之所以能穩(wěn)定存在的原因有二：一是因?yàn)橥饷隗w納米級別的直徑大小可以避免被吞噬，二是因?yàn)橥饷隗w本身攜帶CD47、CD55 和CD59 等分子，可避免被循環(huán)單核-巨噬細(xì)胞清除而穩(wěn)定存在［11-12］，miRNAs 有囊泡膜的保護(hù)，可免受體液中的酶類降解［13］。

外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中被稱為“探路者”，確定轉(zhuǎn)移方向、傳遞轉(zhuǎn)移信號、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)間轉(zhuǎn)化、營造轉(zhuǎn)移前微環(huán)境和傳播轉(zhuǎn)移惡性行為［14］，而外泌體miRNAs 以前體miRNAs（precursor miRNAs，pre-miRNAs）和（或）成熟miRNAs 形式分選入多泡體中，并通過多種機(jī)制被受體細(xì)胞接納，并在受體細(xì)胞中發(fā)揮其對靶基因的調(diào)控作用［7］。目前在ExoCarta（http：//www.exocarta.org）網(wǎng)站上記錄的外泌體miRNAs 已經(jīng)有2838 條信息［15］。

2 循環(huán)外泌體miRNAs 在CRC 中的生物標(biāo)志物作用

2.1 早期診斷標(biāo)志物

多項(xiàng)綜述和薈萃分析闡述了循環(huán)miRNAs 在CRC 早期檢測中的潛在作用［16-18］。在腫瘤中研究最多的診斷標(biāo)志物之一為miR-21。Yu 等人［19］的薈萃分析納入了9 項(xiàng)研究，共有746 例CRC 患者和476 例健康者，匯總后發(fā)現(xiàn)miR-21 對CRC 的診斷敏感性和特異性分別是72%和85%，提示其在CRC 中具有良好的診斷標(biāo)志物潛能。多個(gè)miRNAs 作為組合或miRNAs 聯(lián)合其他生物標(biāo)志物用于CRC 早診篩查，可以提高其檢測效能。一項(xiàng)薈萃分析納入了24 項(xiàng)研究，包括1 558 名CRC 患者和1 085 名健康者的循環(huán)miRNAs 的檢測結(jié)果，使用隨機(jī)效應(yīng)模型分析納入的循環(huán)miRNAs 對CRC診斷效能的總體水平，這些循環(huán)miRNAs 對CRC的診斷敏感性和特異性分別為81%和84%。而將單一miRNA 和miRNAs 組合研究納入亞組分析，結(jié)果顯示，與單一miRNA（敏感性和特異性都為78%）相比，miRNAs 組合在CRC 中具有更高的診斷敏感性（84%）和特異性（87%）［20］。另一項(xiàng)研究也表示miRNAs 組合具有更高的準(zhǔn)確性，在早期CRC 患者中敏感性可高達(dá)90%，特異性高于80%［21-22］。然而，在探究CRC 循環(huán)外泌體miRNAs表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-1246 和miR-23a 的靈敏度可分別高達(dá)95%和92%，提示血液中外泌體來源的miRNAs 可能更具有成為CRC 的診斷標(biāo)志物的潛能［23］。

2.2 預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物

循環(huán)miRNAs 作為預(yù)后生物標(biāo)志物在早期和晚期CRC 患者中均有顯著價(jià)值。有研究分析Ⅰ～Ⅳ期CRC 患者血清中miR-21 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與CRC 生存率顯著相關(guān)［24］。Fesler 等［25］在評述中匯總了miR-92a、miR-92c、miR-21、miR-141、miR-200c、miR-181b 等指標(biāo)與CRC 的淋巴轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為CRC 的預(yù)后指標(biāo)。Ferracin 等［26］的分析了已報(bào)道的20 余個(gè)在CRC 患者中顯著差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs，發(fā)現(xiàn)這些miRNAs 在CRC 循環(huán)中的表達(dá)水平隨腫瘤的惡化進(jìn)程而變化，惡性程度越高miRNAs 表達(dá)差異倍數(shù)越大，可以作為CRC 的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和預(yù)后預(yù)警標(biāo)志物。miR-29c 有望成為CRC 早期復(fù)發(fā)（局部復(fù)發(fā)或切除后1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測指標(biāo)［27］。循環(huán)miR-1290、miR-122 和miR-203 的水平可能對早期CRC 患者有預(yù)后意義，miR-203 還與轉(zhuǎn)移性CRC 的預(yù)后差密切相關(guān)［28-30］。血清外泌體miR-19a 過表達(dá)可以預(yù)測CRC 復(fù)發(fā)［31］。血漿外泌體miR-21 可用作預(yù)測不同TNM 分期CRC 患者復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的分子標(biāo)志物［32］，相關(guān)研究較多，充分體現(xiàn)了循環(huán)外泌體miRNAs 在CRC 中具有不同層面的預(yù)后價(jià)值。

2.3 治療反應(yīng)/療效評價(jià)標(biāo)志物

奧沙利鉑是轉(zhuǎn)移性CRC 的一線化療藥物，研究表明循環(huán)中miR-106a，miR-484、miR-130、miR-27b，miR-148a，miR-326 等分子可能作為奧沙利鉑化療方案治療CRC 的療效評價(jià)指標(biāo)［33］。有些外泌體miRNAs 可能有KRAS 依賴性，如miR-100 在KRAS 突變型患者的外泌體中上調(diào)，提示這類miRNAs 可能參與CRC 靶向治療的耐藥產(chǎn)生［34］。檢測CRC 治療前后循環(huán)miRNAs 差異表達(dá)水平可能預(yù)示著CRC 對治療的反應(yīng)/療效情況［35］。目前闡明循環(huán)外泌體miRNAs 在預(yù)測CRC 對化療和靶向藥物反應(yīng)性和療效中的作用研究相對較少，但探尋CRC 的治療反應(yīng)/療效評價(jià)標(biāo)志物對臨床醫(yī)師制定決策具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上，循環(huán)外泌體miRNAs 作為CRC 的診斷、預(yù)后預(yù)測、風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、療效評價(jià)等生物標(biāo)志物是非常有希望的。但很多研究結(jié)論存在廣泛的不一致，一個(gè)重要原因是存在樣品選擇偏倚、運(yùn)輸和處理不當(dāng)、血細(xì)胞污染等問題［36］。所以，血液樣本收集和處理標(biāo)準(zhǔn)化很關(guān)鍵。

3 血液樣本收集及預(yù)處理

根據(jù)液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用的專家共識［37］推薦，血液樣本一般非空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘部靜脈血，建議不少于10 ml，排除凝血功能障礙、免疫缺陷疾病等患者，避免樣本凝血、溶血等情況。若是采用EDTA-K2 抗凝管：采血后輕柔顛倒8～10次，即時(shí)冰浴送檢。若需獲得血漿標(biāo)本，建議2 h內(nèi)完成兩步離心。第一步低溫（4℃）條件下，先以1 900×g，離心10 min，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片吸取上清；第二步以16 000×g，離心10 min，進(jìn)一步除去殘留細(xì)胞碎片。血漿標(biāo)本可保存于-80℃冰箱或直接抽提進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若是Streck 型采血管則可室溫保存3～5 天，7 天內(nèi)進(jìn)行上述方法分離儲存即可。若需獲得血清樣本，可待血液自然凝固后取上清，再參照上述兩步離心法處理并儲存。

標(biāo)準(zhǔn)化的樣品處理至關(guān)重要，血液中血細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和血小板等衍生的miRNAs 都將顯著影響循環(huán)miRNAs 的水平，樣本處理不當(dāng)引起的溶血或血小板活化都將改變血液樣品中的miRNAs。有研究也建議根據(jù)美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）早期檢測研究網(wǎng)絡(luò)（the Early Detection Research Network，EDRN）的方案，將全血樣品立即處理成血清或血漿［25］（https：//edrn.nci.nih.gov/）。此外，血清中各種因子和其他污染物也可影響miRNAs 的定量。應(yīng)注意不同的miRNAs 本身表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，在處理的過程中有不同降解程度，導(dǎo)致miRNAs之間的比例變化［38-39］?？刂七@些因素對結(jié)果造成的偏倚是循環(huán)miRNAs 臨床轉(zhuǎn)化中的一大挑戰(zhàn)。

4 循環(huán)外泌體miRNAs 臨床轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)和研究局限

盡管很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示循環(huán)外泌體miRNAs在腫瘤中扮演重要角色，但其在臨床實(shí)踐中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。除上述提到的樣本收集和預(yù)處理的非標(biāo)準(zhǔn)，還缺乏數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方案［36］，入組的患者數(shù)量往往有限，更普遍的原因是缺乏臨床獲益的明確證據(jù)［40］。主要體現(xiàn)在循環(huán)外泌體miRNAs 腫瘤特異性差；實(shí)驗(yàn)室間差異大，結(jié)果重復(fù)性差；循環(huán)外泌體純化鑒定困難和外泌體形成及內(nèi)容物分選機(jī)制不明確等方面。

4.1 循環(huán)外泌體miRNAs 腫瘤特異性差

miRNAs 腫瘤特異性問題是臨床實(shí)踐中的一大挑戰(zhàn)。一項(xiàng)關(guān)于循環(huán)miR-21 的研究發(fā)現(xiàn)CRC、乳腺癌、肺癌、食道癌和胃癌患者的血清miR-21 均高表達(dá)［41］。同樣，外泌體miR-10b 也參與乳腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的進(jìn)展［42-44］。Leidner 等［45］發(fā)現(xiàn)13 種miRNAs 可作為乳腺癌的候選生物標(biāo)志物，但其中10 種被發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤類型中顯著差異表達(dá)。這些研究證明miR-21、miR-10b 等分子不是任何一種癌癥類型特異的，是廣譜腫瘤標(biāo)志物。甚至一些miRNAs 的差異表達(dá)都不是腫瘤特異的，在應(yīng)激反應(yīng)、炎性增生等變化中也存在顯著差異［46］。

4.2 實(shí)驗(yàn)室間差異大，結(jié)果重復(fù)性差

循環(huán)miRNAs 研究領(lǐng)域另一挑戰(zhàn)是結(jié)果重復(fù)性低。He 等人［16］在搜集了25 項(xiàng)相關(guān)研究進(jìn)行薈萃分析，共納入2 146 例CRC 患者和1 267 例健康對照者，發(fā)現(xiàn)了78 個(gè)差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs。然而被大部分研究驗(yàn)證到的靶標(biāo)也只有寥寥幾個(gè)，只有miR-21、miR-29a、miR-15b 等表達(dá)量高者。另一項(xiàng)研究在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)158 個(gè)差異表達(dá)的候選miRNAs，其中有16 個(gè)在2 個(gè)研究中重疊，但沒有一個(gè)miRNA 在3 個(gè)研究中重疊［45］。研究之間顯著的差異性可由多種因素造成，如：單個(gè)miRNAs 驗(yàn)證的樣本數(shù)量相對較少、樣本來源類型不同（血漿、血清與全血）、檢測技術(shù)和使用的參比標(biāo)準(zhǔn)不同等［40］。

外泌體的研究表示，使用WB、ELISA 和粒徑方法鑒定腫瘤患者和非腫瘤患者血漿樣本來源的外泌體，二者存在顯著差異［47］。而另有研究表示，在多種腫瘤類型中，與非腫瘤的個(gè)體相比，血漿或血液中循環(huán)EVs 或微粒水平均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［48］。這種截然相反的結(jié)果可能部分原因是由樣品采集或囊泡計(jì)數(shù)方法的差異導(dǎo)致［1］。實(shí)際上，有人建議應(yīng)使用粒子數(shù)與蛋白質(zhì)濃度的比率來解決實(shí)驗(yàn)室間EVs 測定的差異［49］。當(dāng)然，只有隨著技術(shù)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化才能減少數(shù)據(jù)的不一致性。

4.3 循環(huán)外泌體純化鑒定存在疑問

外泌體純度不高可能是樣品采集、預(yù)處理、儲存和運(yùn)輸過程不規(guī)范或囊泡計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法差異導(dǎo)致。在臨床血液樣本中測定EVs（包括外泌體）水平的另一個(gè)關(guān)鍵影響因素是血小板產(chǎn)物的水平。血小板來源的EVs 占據(jù)血液中EVs 的最大比率，并且這些血小板EVs 的水平隨年齡、疾病負(fù)荷和感染等疾病狀態(tài)而顯著變化［50］。此外，脂蛋白顆粒，蛋白質(zhì)復(fù)合物和類似EVs 大小的其他微粒在血液中占比都可能高于EVs［49，51-52］。目前外泌體的純化方法主要是以超速離心為代表的各式離心法和以試劑盒為代表的免疫親和沉淀法，鑒定方法主要是針對外泌體的直徑大小和其攜帶蛋白的特點(diǎn)做定性測定，有WB、ELISA、粒徑、流式檢測等。這些純化和鑒定的方法依然存在很多的局限和疑問，不能很好的把外泌體從復(fù)雜的循環(huán)中純化鑒定出來，更不能滿足臨床轉(zhuǎn)化需求。

有些研究者也致力于生產(chǎn)臨床級GMP 外泌體。Kalluri 博士等人［53］生產(chǎn)出具有靶向致癌Kras能力的工程化外泌體（iExosomes）。并在體外體內(nèi)研究中證實(shí)了這種iExosomes 能夠抑制kras，增加胰腺癌小鼠模型的存活率。該研究建立了一套臨床級治療性外泌體生產(chǎn)、質(zhì)檢等操作流程，為外泌體在其他類型疾病的治療應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。但目前這些工程化技術(shù)還只在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行探究。

4.4 外泌體形成及內(nèi)容物分選機(jī)制不明確

目前EVs 分離方法和亞群異質(zhì)性區(qū)分還存在很大的挑戰(zhàn)，雖然研究者們更關(guān)注外泌體，實(shí)際上外泌體為何更重要還未能從分子機(jī)制層面解釋。目前的研究揭示了外泌體的生成、攝取和載物分選都涉及內(nèi)涵體分選復(fù)合體（ESCRT complex）及相關(guān)蛋白［54］，而Dicer、Ago2 和TRBP 參與了外泌體miRNAs 的加工分選［55-56］。熱休克蛋白HSP90也能刺激外泌體的釋放，有助于含有潛在毒性蛋白的外泌體擴(kuò)散到周圍環(huán)境導(dǎo)致疾病傳播［57］。但是，這些關(guān)鍵分子具體是如何調(diào)控外泌體形成和miRNAs 等內(nèi)容物分選，還有哪些重要分子參與這一分子機(jī)制等問題都有待深入探究。

4.5 外泌體作為治療載體的潛能和挑戰(zhàn)

外泌體是人體的天然囊泡遞送系統(tǒng)，因其理想的粒徑大小及生物膜相容性，作為腫瘤的治療載體或藥劑具有很大的潛能。有研究通過將可注射水凝膠裝載間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體用于后肢缺血的治療并取得了不錯(cuò)的效果［58］。Kalluri 博士等［53］通過電轉(zhuǎn)將靶向KRAS 突變的siRNA 導(dǎo)入成纖維細(xì)胞來源的外泌體中生成iExosome。iExosome 經(jīng)過體內(nèi)運(yùn)輸?shù)竭_(dá)癌細(xì)胞處，將含siRNA 的內(nèi)容物遞送至癌細(xì)胞，激活相關(guān)通路，最終抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。目前已有幾種基于EVs 的靶向藥物遞送系統(tǒng)在癌癥、丙型肝炎、神經(jīng)退行性病變，炎癥疾病等中展現(xiàn)了巨大的潛能［59］。但外泌體載體在體內(nèi)駐留時(shí)間和穩(wěn)定性尚值得探討，優(yōu)化外泌體應(yīng)用策略是提高外泌體利用率的有效方式。

5 小結(jié)和展望

循環(huán)外泌體miRNAs 是循環(huán)miRNAs 的主要來源，在樣本收集和預(yù)處理、生物標(biāo)志物作用、臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)、研究不足等方面存在很多共性。目前由于外泌體純化鑒定等挑戰(zhàn)的存在，循環(huán)外泌體miRNAs和循環(huán)miRNAs 2 方面的研究是交融的，本文一并進(jìn)行了闡述。循環(huán)miRNAs 在2008年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，歷經(jīng)10年余的發(fā)展，它依然是研究熱點(diǎn)卻沒有在臨床中得到實(shí)踐，這說明它具有強(qiáng)大的潛能，同時(shí)又存在很多的不足和挑戰(zhàn)。循環(huán)外泌體miRNAs 具備一定的腫瘤特異性和液體活檢的簡便性，在結(jié)直腸癌中具有作為早期/輔助診斷、預(yù)后預(yù)警、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、療效評價(jià)等生物標(biāo)志物的潛能。但眾多的研究存在血液樣本收集和處理不規(guī)范、miRNAs 腫瘤特異性差、結(jié)果重復(fù)性差、循環(huán)外泌體純化鑒定等方面的不足或挑戰(zhàn)。目前有很多新的儀器設(shè)備和技術(shù)方法正在推進(jìn)循環(huán)外泌體miRNAs 的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

隨著數(shù)字PCR、微流控芯片等新興技術(shù)對實(shí)驗(yàn)方案的不斷優(yōu)化，相信不久在循環(huán)miNRAs 領(lǐng)域?qū)贫ǔ龈右?guī)范統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來解決miNRAs的定量不準(zhǔn)、重復(fù)性差等問題。隨著外泌體形成機(jī)制和miRNAs 在循環(huán)中的調(diào)節(jié)機(jī)制的不斷揭示，循環(huán)外泌體miRNAs 的腫瘤特異性和標(biāo)志物潛能將被進(jìn)一步挖掘，相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化也將順利推進(jìn)，也許未來的醫(yī)者通過簡單的血液測試就可以識別對治療反應(yīng)差的患者或發(fā)現(xiàn)需要治療干預(yù)的目標(biāo)人群，這對指導(dǎo)臨床治療選擇意義重大。

此外，隨著光學(xué)/電子顯微鏡以及微納米技術(shù)取得的新突破，已經(jīng)能夠分離并分析單個(gè)（亞）囊泡的膜結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性。相信未來對EVs 異質(zhì)性，亞群分型的研究將更加細(xì)致。此外，實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示iExosomes 可以經(jīng)過體內(nèi)運(yùn)輸?shù)竭_(dá)癌細(xì)胞處，將含siRNA 的內(nèi)容物遞送至癌細(xì)胞，影響腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，相信通過臨床轉(zhuǎn)化策略進(jìn)一步完善，未來將有可能通過修飾外泌體攜帶更多有效的治療靶點(diǎn)，靶向外泌體miRNAs 的治療手段也將得到有效驗(yàn)證。