李 蓉,杜軍輝,姚國敏,王小娣,姚 楊

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科,西安 710077;2西安交通大學(xué)附屬西安市第九醫(yī)院眼科;3西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[1],高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管慢性損傷,最終出現(xiàn)增生性DR(proliferative DR,PDR)嚴(yán)重危害患者視力健康[2],影響其生存質(zhì)量,并帶來巨大的社會負(fù)擔(dān)。抗新生血管藥物的出現(xiàn)為PDR帶來了治療前景[3],但并非對所有患者均治療有效,故研究DR的發(fā)病機(jī)制,探索新生血管治療的新策略尤為重要。

研究表明,脂肪細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)脂聯(lián)素(adiponectin,APN)與糖尿病等多種代謝性疾病的發(fā)生有關(guān),APN在這些疾病中可能發(fā)揮有益作用[4-6]。在APN與病理性視網(wǎng)膜新生血管方面的研究提示,APN對缺血缺氧導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管損傷起著保護(hù)作用[7,8],但APN在各種代謝性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制還不完全清楚。據(jù)報(bào)道,高糖可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。本研究旨在觀察APN是否能促進(jìn)高糖條件下的RF/6A細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,從而對RF/6A細(xì)胞起到保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

RF/6A細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Invitrogen公司),青霉素、鏈霉素(美國Hyclong公司);APN(金斯瑞生生物科技有限公司),CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司),細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。兔單抗Bax(美國Cell signaling公司),兔單抗Bcl2(美國Cell signaling公司),兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司),HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO),Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific),CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN)。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

將RF/6A細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到80%時,用0.25%胰酶消化細(xì)胞,終止消化后收集細(xì)胞,PBS清洗細(xì)胞2次,1 200 r/min,離心3 min,加入培養(yǎng)基,制成單細(xì)胞懸液,按1 ∶3的比例傳代,37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞處理及分組

將處于對數(shù)生長期的RF/6A細(xì)胞消化,用相應(yīng)培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,按照每孔5×105個細(xì)胞接種于6孔板,按照如下分組進(jìn)行加藥處理:空白對照組(PBS),甘露醇對照組(25 mmol/L甘露醇),高糖組(25 mmol/L D-葡萄糖),高糖+APN組(25 mmol/L D-葡萄糖+10 μg/ml APN),在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。

1.4 CCK-8法檢測RF/6A細(xì)胞增殖

消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,用培養(yǎng)基制成5×104個細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞接種于96孔板(每孔100 μl),同時設(shè)置空白對照孔,周圍孔加入100 μl PBS,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。按照上述分組加藥處理48 h,向每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)4 h,振蕩10 min,用全自動酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光值(OD)。計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)=(各組平均OD值-空白孔平均OD值)/(對照組平均OD值-空白孔平均OD值)×100%。

1.5 流式檢測RF/6A細(xì)胞凋亡

用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞,終止消化后收集細(xì)胞;PBS清洗2次,1 500 r/min,5 min;按照Annexin Ⅴ-APC-7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明操作:加入500 μl Binding Buffer,重懸細(xì)胞;5 μl AnnexinⅤ-APC混勻后加入5 μl 7-AAD,混勻;室溫避光反應(yīng)15 min(同時設(shè)陰性對照,即正常細(xì)胞不加Annexin Ⅴ-APC-7-AAD);流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Western blot檢測RF/6A細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)

細(xì)胞處理完成之后,收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗滌3次,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μl,混勻,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清,BCA法測定蛋白濃度,取40 μg等量蛋白上樣。SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)室溫浸泡PVDF膜2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次,每次5 min,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶50 000),室溫孵育2 h,洗膜后ECL顯色,沖洗晾干后掃描膠片,BandScan凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值。以GAPDH為內(nèi)參,以目的蛋白/GAPDH條帶灰度值作為其相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 APN對高糖條件下RF/6A細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示,空白對照組、甘露醇對照組、高糖組、高糖+APN組的RF/6A細(xì)胞增殖率分別為100%±0%,99.09%±0.46%,71.42%±2.29%,90.87%±1.68%。各組總體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=254.16,P<0.001)。空白對照組與甘露醇對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細(xì)胞增殖率比空白對照組和甘露醇對照組降低(均P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細(xì)胞增殖率明顯升高(P<0.001,見圖1)。

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖1 各組RF/6A細(xì)胞增殖率的比較Figure 1 Comparison of the proliferation rate of RF/6A cells among four groups

2.2 APN對高糖條件下RF/6A細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與空白對照組和甘露醇對照組比較,高糖組細(xì)胞的凋亡增強(qiáng),分別表現(xiàn)為兩種凋亡標(biāo)志蛋白Bax(促進(jìn)凋亡)表達(dá)條帶的明顯增強(qiáng)和Bcl-2(抑制凋亡)的明顯減弱。當(dāng)采用APN處理細(xì)胞后,Bax的表達(dá)則明顯降低,而Bcl-2的表達(dá)明顯升高(見圖2)?？瞻讓φ战M、甘露醇對照組、高糖組和高糖+APN組細(xì)胞中,Bax的相對表達(dá)量分別為0.28±0.02,0.29±0.02,0.64±0.01和0.54±0.03;Bcl-2的相對表達(dá)量分別為0.64±0.01,0.66±0.01,0.28±0.01和0.39±0.01。Bax和Bcl-2的相對表達(dá)組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=257.13,P<0.001;F=1087.54,P<0.001)。組間比較顯示,空白對照組與甘露醇對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細(xì)胞Bax的表達(dá)比空白對照組和甘露醇對照組增多,Bcl-2的表達(dá)較這兩組減少(均P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細(xì)胞Bax的表達(dá)明顯降低,Bcl-2的表達(dá)明顯升高(均P<0.001,見圖3)。

圖2 Western blot檢測各組RF/6A細(xì)胞Bax和 Bcl-2的蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 in different groups by Western blot

2.3 APN對高糖條件下RF/6A細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與空白對照組和甘露醇對照組比較,高糖組細(xì)胞的凋亡率增加,高糖+APN組細(xì)胞凋亡率則明顯下降(見圖4)?？瞻讓φ战M、甘露醇對照組、高糖組和高糖+APN組細(xì)胞的凋亡率分別為5.17±0.27，5.55±0.35，18.37±0.44和10.46±0.70。組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=518.86,P<0.001)。組間比較提示,空白對照組與甘露醇對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細(xì)胞凋亡率比空白對照組和甘露醇對照組增多(P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.001,見圖5)。

3 討論

DR是全球工作年齡人群致盲的首要原因,其臨床特征主要是毛細(xì)血管通透性增加、視網(wǎng)膜水腫以及內(nèi)皮細(xì)胞增生[10]。糖尿病導(dǎo)致DR發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜,雖經(jīng)過多年的體內(nèi)外研究,但目前對DR的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。既往關(guān)于糖尿病并發(fā)癥的機(jī)制研究主要集中在多元醇通路、非酶糖基化學(xué)說、氧化應(yīng)激和蛋白激酶C的活化這五個經(jīng)典途徑,視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡是各種機(jī)制的共同通路[11]。細(xì)胞凋亡是生物體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,由基因控制的高度有序的細(xì)胞程序性死亡,是生物體為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動結(jié)束其生命的過程,涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控過程[12]。本研究結(jié)果提示,高糖刺激可以明顯減少RF/6A細(xì)胞增殖,導(dǎo)致其細(xì)胞活力下降,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[13]。進(jìn)一步流式和免疫印跡法分析結(jié)果提示,凋亡增加是高糖導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降的原因之一,與采用其他方法檢測凋亡所取得的結(jié)果類似[13]。

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖3 各組RF/6A細(xì)胞Bax和Bcl-2的相對蛋白表達(dá)量Figure 3 The relative expression of Bax and Bcl-2 by RF/6A cells in different groups

圖4 流式細(xì)胞儀檢測各組RF/6A細(xì)胞凋亡率Figure 4 Cellular apoptosis rate in different groups by flow cytometry

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖5 各組RF/6A細(xì)胞凋亡率的比較Figure 5 The apoptosis rate of RF/6A cells in different groups

視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡已被視為導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變、血管功能異常、DR、青光眼等不可逆致盲眼病的中心事件[14]。在DR大鼠模型中發(fā)現(xiàn),在糖尿病發(fā)生早期就可見到血管細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡發(fā)生,血管周細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障破壞,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致視功能的損傷[14]。糖尿病誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制雖然仍不十分明確,但與這些細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因主要包括bcl-2家族。Bcl-2是研究最早且與凋亡有關(guān)的原癌基因,是人類濾泡型淋巴瘤的細(xì)胞遺傳標(biāo)志物,其表達(dá)蛋白可以抑制凋亡。Bcl-2蛋白廣泛存在于造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞。目前認(rèn)為該家族可細(xì)分成兩大類:抗凋亡基因,如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等和促凋亡基因,如Bax、Bik、Bak等[15]。本研究提示,RF/6A細(xì)胞表達(dá)Bcl-2和Bax這兩種凋亡關(guān)鍵蛋白,高糖作用后促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降,與在周細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相似。研究者也將視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞置于高濃度的葡萄糖溶液中體外培養(yǎng),觀察到毛細(xì)血管周細(xì)胞的大量凋亡,并且細(xì)胞中Bax基因表達(dá)增強(qiáng)與Bcl-2基因表達(dá)減少,認(rèn)為二者的表達(dá)變化對周細(xì)胞的凋亡起到了調(diào)控作用[16]。進(jìn)一步研究提示,上述改變主要與高糖所致的氧化應(yīng)激損傷引起線粒體功能紊亂,啟動細(xì)胞內(nèi)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。Bcl-2家族在此過程中起主要的調(diào)節(jié)作用,在高血糖狀態(tài)下,Bcl-2的含量降低、Bax含量增加,線粒體膜通透性增高,激活caspase-9及caspase-3等重要作用的蛋白酶,從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號[17]。

APN是一種主要由脂肪細(xì)胞特異性分泌的生物活性物質(zhì),編碼人脂聯(lián)素的基因位于染色體3q27,該位點(diǎn)與糖尿病和心血管疾病的易患性相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn),APN是聯(lián)系脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞的重要媒介,且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。APN的功能尚未完全證實(shí),能夠通過多種復(fù)雜信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂代謝,與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。人類APN的血清水平與脂肪量呈反比,是唯一與脂肪組織呈負(fù)相關(guān)、對人體起保護(hù)作用的脂肪因子,具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性和抑制血管生成的作用[19,20]。臨床研究發(fā)現(xiàn),較低濃度的血清總APN和高分子量APN水平可能參與非增殖性DR的發(fā)生,總APN水平可能與DR的嚴(yán)重程度有關(guān)[21]。血清APN水平是DR病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,參與了DR的發(fā)生和發(fā)展,可作為預(yù)測評估糖尿病患者視網(wǎng)膜病變損傷程度的指標(biāo)[22]。在視網(wǎng)膜血管病變的動物模型中發(fā)現(xiàn),APN是視網(wǎng)膜病理性微血管形成的負(fù)向調(diào)控者,對視網(wǎng)膜血管損傷起著保護(hù)作用[7,8]。本研究結(jié)果表明,APN可以促進(jìn)高糖條件下的RF/6A細(xì)胞的存活及增殖,抑制細(xì)胞凋亡,提示APN對高糖所致的RF/6A細(xì)胞損傷起一定的保護(hù)作用。