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強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血miR-155表達(dá)及Th17/Treg平衡的關(guān)系

2019-03-20 06:33:58李文清
關(guān)鍵詞:外周血細(xì)胞因子機(jī)體

李文清

(青海省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,西寧 810000)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是以髖部、腰部、頸部等關(guān)節(jié)疼痛為臨床表現(xiàn)的一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病,多認(rèn)為是由感染、免疫或遺傳等因素引發(fā),患者骶髂關(guān)節(jié)、肌腱及一些肌腱附著點(diǎn)被炎性細(xì)胞浸潤(rùn),引起外周關(guān)節(jié)炎,對(duì)生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。研究表明[1],T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)在機(jī)體自身免疫疾病發(fā)生過(guò)程中起重要作用,可參與調(diào)控體內(nèi)免疫平衡。輔助性T細(xì)胞17(T helper cells 17,Th17)在CD4輔助性T細(xì)胞(T helper cells,Th)亞群中以分泌促炎細(xì)胞因子IL-17被廣泛認(rèn)知,其與具有抑制炎癥反應(yīng)作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg細(xì)胞)在機(jī)體中的平衡狀態(tài)對(duì)自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。微小核糖核酸-155(microRNA-155,miR-155)是微小核糖核酸(microRNA,miRNA)家族中可對(duì)T細(xì)胞增殖、分化起調(diào)節(jié)作用的一種多功能miRNA,在自身免疫疾病患者外周血中異常表達(dá)。目前學(xué)術(shù)界對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血中miR-155、Th17、Treg表達(dá)水平已多有研究[3],但對(duì)miR-155表達(dá)與Th17/Treg平衡的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究擬對(duì)AS患者外周血中miR-155表達(dá)水平和Th17、Treg細(xì)胞分布狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定,探討AS患者外周血miR-155表達(dá)與Th17/Treg平衡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-04~2018-04在本院診治的AS患者64例為研究對(duì)象,其中男35例,女29例,年齡20-67歲,平均年齡(33.26±5.74)歲,病程1-9年,平均病程(3.58±1.65)年。另取同期在本院體檢健康志愿者60例為對(duì)照組,其中男32例,女28例,年齡22-68歲,平均年齡(35.84±6.19)歲。兩組研究對(duì)象在年齡、性別等基本資料方面比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)1984年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的AS診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診為AS患者;②納入研究前3個(gè)月未進(jìn)行過(guò)免疫調(diào)節(jié)治療;③患者知曉并同意本次研究,簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠期、哺乳期患者;②合并其他風(fēng)濕性疾病患者;③合并肝、腎、心腦血管等器官系統(tǒng)疾病患者;④精神不正常患者。

1.3 主要儀器與試劑

5 ml EDTA抗凝管、肝素鈉抗凝管(上海生工),PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司),IL-6、IL-17、IL-23ELISA檢測(cè)試劑盒(上海晶美生物技術(shù)有限公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155、Foxp3 mRNA水平測(cè)定 于清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml,置于EDTA抗凝管中,采用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),采用熒光定量PCR法對(duì)miR-155、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor p3,Foxp3)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定,采用TRIzol法提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA,miR-155以U6為內(nèi)參,進(jìn)行定量PCR反應(yīng),條件:95 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃ 1 min,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共進(jìn)行45個(gè)反應(yīng)循環(huán)。Foxp3 mRNA以GAPDH為內(nèi)參,條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進(jìn)行40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1定量PCR引物序列

Table1QuantitativePCRprimersequences

基因 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′)miR-155GCGAAAGCATTTGCCAAGAACATCACAGACCTGTTATTGCU6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGFoxp3AGGAAAGGAGGATGGACGGTGGCTGGTTGTGAAGGGAPDHCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

1.4.2 Th17、Treg細(xì)胞分布狀態(tài) 于清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml,置于肝素鈉抗凝管中,分離PBMC并收集提純后的PBMCs,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml接種于6孔板中,加入佛波醇乙酯25 ng/ml 2 μl,離子霉素1 μg/ml 10 μl,放入37 ℃無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中,1 h后向加1 μl高爾基阻斷劑,培養(yǎng)4-6 h后收集細(xì)胞。以CD4-FITC設(shè)門,固定,破膜,采用IL-17A PE(5 μl)標(biāo)記Th17細(xì)胞,CD4+IL-17A+的細(xì)胞被標(biāo)記為Th17細(xì)胞;采用CD25-PC(5 μl)、CD25 PE(5 μl)標(biāo)記Treg細(xì)胞,CD4+CD25+CD127low的細(xì)胞被標(biāo)記為Treg細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞百分率,檢測(cè)結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度表示。

1.4.3 Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子血清水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定研究對(duì)象血清白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)、白細(xì)胞介素17(interleukin 17,IL-17)、白細(xì)胞介素23(interleukin 23,IL-23)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-Β,TGF-β)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155、Foxp3水平測(cè)定結(jié)果

AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Foxp3相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2對(duì)照組與AS組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155、Foxp3水平測(cè)定結(jié)果

Table2LevelsofmicroRNA-155andFoxp3inperipheralbloodmononuclearcellsincontrolgroupandASgroup

組別nmiR-155相對(duì)表達(dá)量Foxp3相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組601.04±0.211.42±0.33AS組641.75±0.380.64±0.17 t12.98416.381 P0.0000.000

2.2 Th17、Treg細(xì)胞比率測(cè)定結(jié)果

AS組Th17細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),Treg細(xì)胞比率顯著低于對(duì)照組(P<0.05,見(jiàn)圖1,表3)。

圖1 Th17和Treg細(xì)胞流式分析圖Figure 1 Flow cytometry of Th17 and Treg cell

表3對(duì)照組與AS組Th17、Treg細(xì)胞比率測(cè)定結(jié)果

Table3RatioofTh17andTregcelldistributionbetweencontrolgroupandASgroup

組別nTh17細(xì)胞(%)Treg細(xì)胞(%) 對(duì)照組602.56±0.419.26±2.03 AS組645.37±0.825.11±0.94 t24.36214.447 P0.0000.000

2.3 Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子血清水平檢測(cè)結(jié)果

AS組IL-2、IL-6、IL-17、IL-23水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),IL-10和TGF-β與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表4)。

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)系數(shù)法分析顯示,AS患者外周血miR-155表達(dá)水平與Th17、IL-17正相關(guān)(r=0.779,P<0.01;r=0.854,P<0.01),與Treg、Foxp3負(fù)相關(guān)(r=-0.801,P<0.01;r=-0.871,P<0.01,見(jiàn)表5、圖2)。

表4Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子血清水平檢測(cè)結(jié)果(pg/ml)

Table4SerumlevelsofTh17andTregcell-relatedcytokines(pg/ml)

組別nIL-2IL-6IL-10IL-17IL-23TGF-β對(duì)照組6015.34±4.483.15±0.440.18±0.428.26±1.640.04±0.010.38±0.06AS組6428.29±5.156.05±0.970.19±0.4925.95±5.160.25±0.050.39±0.06 t14.965 21.662 0.122 26.064 32.9140.927 P0.0000.0000.9030.0000.0000.356

表5外周血miR-155水平與Th17、Treg細(xì)胞比率及IL-17、Foxp3表達(dá)的相關(guān)性分析

Table5CorrelationanalysisofperipheralbloodmiRNA-155levelwithTh17,TregcellratioandIL-17,Foxp3expression

因子miR-155rP Th170.7960.000 Treg-0.7540.000 IL-170.8240.000 Foxp3-0.8420.000

3 討論

AS屬自身免疫性疾病,發(fā)病早期無(wú)顯著臨床癥狀,不易被發(fā)現(xiàn),患者致殘率高,且病因較為復(fù)雜,與遺傳、環(huán)境、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡及微生物和宿主的相互作用等多方面因素相關(guān)。研究表明[5],位于人類21號(hào)染色體上的miR-155可參與機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)過(guò)程,調(diào)控T淋巴細(xì)胞增殖分化,促進(jìn)炎性因子表達(dá),導(dǎo)致免疫反應(yīng)失調(diào)。陳倩云等[6]研究表明miR-155可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌,刺激Th17細(xì)胞活化,促進(jìn)自身抗體形成,參與自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展。Zhou等[7]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),miR-155在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周單核細(xì)胞中高表達(dá),表達(dá)水平是對(duì)照組的2倍左右。本研究結(jié)果顯示,AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,提示miR-155在AS疾病患者外周血中高表達(dá)。

已有相關(guān)研究表明[8],CD4+T淋巴細(xì)胞功能異常、活性改變是影響AS疾病發(fā)展的重要因素。CD4+T細(xì)胞作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分,可分為Th1、Th2、Th17、Treg等多個(gè)相互聯(lián)系和牽制的亞群,這些亞群可分泌細(xì)胞因子,形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),調(diào)控免疫細(xì)胞表達(dá)。Th17細(xì)胞主要分泌炎癥細(xì)胞因子IL-17,IL-17是一種重要的炎癥介質(zhì),它可以激活免疫T細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)增活素、細(xì)胞黏附分子等,促進(jìn)血管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子,刺激單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化,聚集樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞引起炎性浸潤(rùn),從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[9]。此外,Th17細(xì)胞還可以分泌IL-6、IL-22等細(xì)胞因子,在對(duì)外來(lái)細(xì)菌和真菌的免疫應(yīng)答中活化中性白細(xì)胞,進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。IL-17可以與IL-6、IL-1協(xié)同促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子,加快Th17細(xì)胞的分化。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)研究顯示[10],人為敲除或阻斷經(jīng)IL-17受體拮抗劑治療小鼠身上的IL-17后,小鼠軟骨組織受傷程度和關(guān)節(jié)炎癥嚴(yán)重程度得到極大改善。本研究結(jié)果顯示,AS組Th17細(xì)胞比率和IL-17顯著高于對(duì)照組,提示Th17細(xì)胞百分率和細(xì)胞因子IL-17在AS患者中高表達(dá),二者相輔相成相互促進(jìn),共同參與AS疾病發(fā)生發(fā)展。

Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群之一,具有免疫抑制作用,可通過(guò)分泌TGF-β、IL-10或細(xì)胞間接觸介導(dǎo)特異性免疫抑制的調(diào)控性T細(xì)胞,進(jìn)而抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖,控制免疫應(yīng)答強(qiáng)度,維持機(jī)體外周免疫耐受性,減輕組織受傷程度[11]。細(xì)胞因子TGF-β、IL-2和Foxp3是影響Treg細(xì)胞分化的主要因素,Foxp3+Treg細(xì)胞可直接或間接抑制機(jī)體免疫應(yīng)答[12],因此常以Foxp3作為Treg細(xì)胞的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示,AS組Treg細(xì)胞比率和Foxp3表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,提示Treg細(xì)胞百分率和Foxp3在AS疾病患者體內(nèi)低表達(dá)。

圖2 miR-155水平與Th17、Treg、IL-17及Foxp3的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of microRNA-155 levels with Th17, Treg, IL-17 and Foxp3

相關(guān)研究表明[13],Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間存在相互作用,正常機(jī)體中,Th17/Treg細(xì)胞處于平衡狀態(tài),共同參與免疫調(diào)節(jié),維持機(jī)體有效免疫應(yīng)答。在自身免疫疾病患者體內(nèi),處于失衡狀態(tài),對(duì)免疫反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用。一方面,Treg細(xì)胞通過(guò)下調(diào)IL-23和IL-17水平抑制Th17細(xì)胞分化,IL-23是由巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的一種促炎癥細(xì)胞因子,可維持Th17細(xì)胞穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增產(chǎn)生IL-17,已經(jīng)過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)研究證明與自身免疫疾病緊密相關(guān)[14]。任明亮等[15]通過(guò)對(duì)AS患者體內(nèi)Th17和IL-23分布狀態(tài)與水平研究表明,IL-23在AS疾病患者體內(nèi)高表達(dá),且其受體易感性顯著增強(qiáng)。鄔秀娣等[16]研究表明,IL-23在AS患者CD4+T細(xì)胞上高表達(dá),可促進(jìn)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-17。另一方面,TGF-β在低濃度和高濃度狀態(tài)下可分別誘導(dǎo)Th17和Treg細(xì)胞產(chǎn)生,其與IL-6或IL-21結(jié)合時(shí),對(duì)Treg細(xì)胞分化起抑制作用。本研究結(jié)果顯示,AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞顯著增多,Treg細(xì)胞顯著減少,Th17/Treg存在嚴(yán)重失衡現(xiàn)象,這與張立麗等[17]研究結(jié)果一致,提示Th17/Treg細(xì)胞失衡可能促進(jìn)AS疾病的發(fā)展。Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23均屬促炎因子,可分別通過(guò)不同機(jī)制誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,導(dǎo)致機(jī)體組織損傷。本研究結(jié)果顯示,AS組IL-2、IL-6、IL-17、IL-23水平顯著高于對(duì)照組,推測(cè)IL-2、IL-6、IL-17、IL-23在AS患者血清中高表達(dá)。IL-10屬抑炎癥因子,可通過(guò)減緩抗原特異性T細(xì)胞繁殖來(lái)控制機(jī)體免疫反應(yīng),影響免疫適應(yīng)性。IL-10可由Th2、Treg等細(xì)胞分泌,來(lái)源較為復(fù)雜,在本研究中,AS組和患者組中IL-10水平無(wú)顯著差異,推測(cè)其不能作為AS疾病評(píng)估指標(biāo)。TGF-β是在控制炎癥因子活化過(guò)程中起作用的一種多效能細(xì)胞因子,可正向調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞分化,維持機(jī)體免疫平衡,但當(dāng)與IL-6共同存在時(shí),可刺激Th17分化,負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果表明TGF-β在AS患者和對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明TGF-β對(duì)AS的參與機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,AS患者外周血miR-155表達(dá)水平與Th17、IL-17正相關(guān),與Treg、Foxp3負(fù)相關(guān),提示miR-155可能通過(guò)影響Th17、Treg細(xì)胞水平,打亂Th17/Treg細(xì)胞平衡狀態(tài),參與AS疾病發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,AS患者外周血中miR-155和Th17細(xì)胞高表達(dá),Treg細(xì)胞低表達(dá),Th17/Treg細(xì)胞出現(xiàn)失衡現(xiàn)象,AS患者外周血miR-155表達(dá)水平與Th17細(xì)胞百分率正相關(guān),與Treg細(xì)胞百分率負(fù)相關(guān)。推測(cè)AS患者外周血中miR-155表達(dá)水平可能影響Th17/Treg細(xì)胞平衡狀態(tài)。

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